Faculté des sciences

Identification, characterisation, and function of adipokinetic hormones and receptor in the African malaria mosquito, "Anopheles Gambiae" (Diptera)

Kaufmann, Christian ; Betschart, Bruno (Dir.)

Thèse de doctorat : Université de Neuchâtel, 2007 ; Th. 1954.

En utilisant la bioinformatique et la biologie moléculaire, nous avons pu identifier chez le principal vecteur africain de la malaria, le moustique, Anopheles gambiae deux hormones adipokinétiques (AKHs): l'octapeptide, Anoga-AKH-I (pQLTFTPAWa) et le décapeptide, Anoga-AKH-II, (pQVTFSRDWNAa). La fonction principale des AKHs est d’induire une hyperlipémie (effet d’adipokinétique), ainsi... Plus

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    Résumé
    En utilisant la bioinformatique et la biologie moléculaire, nous avons pu identifier chez le principal vecteur africain de la malaria, le moustique, Anopheles gambiae deux hormones adipokinétiques (AKHs): l'octapeptide, Anoga-AKH-I (pQLTFTPAWa) et le décapeptide, Anoga-AKH-II, (pQVTFSRDWNAa). La fonction principale des AKHs est d’induire une hyperlipémie (effet d’adipokinétique), ainsi qu’une hypertrehalosémie et une hyperprolinémie. En tant que membres de la famille des AKH, les deux neuropeptides montrent des acides aminés aromatiques conservés en positions quatre et huit. Dans ce travail, nous avons caractérisé chez A. gambiae les deux neuropeptides AKH et nous avons également étudié leur fonction métabolique. Comme tous les neuropeptides, leur cadre de lecture ouvert est caractérisé par la présence d’un peptide signal, de l'hormone (AKH), et du peptide précurseur d’hormone. La différence observée entre les deux Anoga-AKHs indique une paralogie provenant d'une duplication à partir d’un gène ancestral. La comparaison avec d’autres AKHs connues montre que Anoga-AKH-I semble être un orthologue proche de l’AKH de Drosophila melanogaster (Drome-AKH). Quant à la séquence du neuropeptide Anoga-AKH-II, elle partage 80% d’homologie avec la quatrième AKH décrite chez Locusta migratoria (Locmi-HrTH). Ceci laisse penser que ces 2 AKHs sont probablement orthologues d’une AKH ancestrale. Nous avons pu constater que la transcription de Anoga-AHK-I et -II était constante dans les œufs, les larves, les pupes, et les adultes d’A. gambiae. L’expression de ces gènes n’a été retrouvée que dans la tête et le thorax de l’insecte et jamais dans son abdomen. Des analyses plus poussées chez des femelles nourries avec du sucre ou du sang ont montré une transcription similaire et constante. De même, aucun changement n’a été détecté pendant le cycle gonotrophique des femelles en fonction du régime alimentaire. D’autre part, en utilisant l’immunocytochimie et la technique du «radioimmunoassay» (RIA), nous avons pu confirmer l’expression de Anoga-AKH-I et -II dans la tête et le thorax de l’insecte, et l’absence d’expression dans l’abdomen. La source principale d’Anoga-AKH-I est probablement localisée dans les cellules X du corps cardiaque et dans celles des ganglions thoraciques alors que la source d’Anoga-AKH-II se situerait dans les cellules neuro-sécrétrices latérales du protocerebrum. Les comparaisons avec les sources cellulaires de l’octapeptide orthologue d’Anoga-AKH-I chez D. melanogaster ont démontré que, dans la drosophile, la présence d’AKH n’est détectée qu’au niveau du corps cardiaque, tandis que chez le moustique, elle n’est pas limitée à cet organe neurohaemal, mais qu’elle se retrouve également dans les ganglions thoraciques. En ce qui concerne Anoga-AKH-II, la coloration des cellules neuro-sécrétrices latérales du protocerebrum observée en immunohistochimie n’est pas étonnante. En effet, comme ces cellules représentent probablement la source du décapeptide du moustique, ceci renforce l'hypothèse que l’AKH, Locmi-HrTH, décrite chez la locuste et Anoga-AHK-II sont orthologues; les deux hormones semblent être synthétisées dans le cerveau, et non dans le corps cardiaque. Quelques récepteurs d'hormones adipokinétiques (AKHR) ont déjà été caractérisés, nous avons donc effectué des blasts parmi les séquences d’AKHR connues, ce qui nous a permis de prédire un récepteur présumé pour les Anoga-AKHs. Ce récepteur, comme les autres AKHRs, appartient aux récepteurs couplés aux protéines G (GPCR). L’expression du gène de ce récepteur a été mise en évidence durant tout le cycle de vie d’A. gambiae. L’expression n'a pas changé au cours des tests expérimentaux que nous avons effectués avec des mâles et des femelles soumis à un régime alimentaire à base de sucre, ni pendant le cycle gonotrophique des femelles. La fonction principale des AKHs étant de mobiliser des éléments nutritifs comme les lipides, les hydrates de carbone et les acides aminés, nous avons émis l’hypothèse que les AKHRs étaient localisés dans le corps gras, tissus connu pour emmagasiner les principaux métabolites chez les insectes. Effectivement, l'expression des AKHRs n’a été décelée que dans les parois abdominales de l’insecte, là où le corps gras est présent. Une faible expression a cependant été également détectée dans les ovaires, dans lesquels, étonnamment, de l’ARN brut de Anoga-AKH-I a aussi été décelé. La question se pose alors de savoir si Anoga-AKH-I et son récepteur sont impliqués dans l’embryogenèse après la ponte? Anoga-AKH-I provoque la mobilisation des sucres de l’hémolymphe chez les femelles d’A. gambiae qu’elles soient nourries de sucre ou de sang, sans qu’aucun effet ne soit observé sur les lipides. Le trehalose étant le principal sucre de l’hémolymphe utilisé par les moustiques, cette neurohormone, Anoga-AKH-I, devrait être renommée hormone hypertrehalosémique, Anoga-HrTH. D'autre part, comme cela a déjà été décrit pour la quatrième AKH de L. migratoria, aucune mobilisation spécifique de lipides ou d'hydrates de carbone n’a été détectée pour Anoga-AKH-II, le décapeptide d’A. gambiae. Cependant, la Locmi-HrTH a élevé le niveau d'hydrate de carbone chez la blatte américaine, Periplaneta americana, alors qu’aucun effet n’a été observé avec Anoga-AKH-II. Des tests similaires que nous avons effectués chez L. migratoria avec Anoga-AKH-I et -II ont révélé une hyperlipémie avec l’octapeptide du moustique, mais pas avec le décapeptide. De plus, en utilisant la technique d’interférence de l'ARN (RNAi) pour bloquer l'expression du gène du récepteur d'Anoga-AKH-I dans le corps gras, aucune hypertrehalosémie n’a été induite par Anoga-AKH-I. Nous avons ainsi montré, indirectement, qu’Anoga-AKH-I agit à travers ce récepteur GPCR. L’ensemble de ce projet était basé sur le fait que A. gambiae utilise des lipides et des hydrates de carbone lors de ses vols. Les AKHs mobilisant ces métabolites de vol, comme cela a été montré chez d’autres insectes, nous avons étudié l’influence de ce type d’hormone sur le vol. Nous avons ainsi pu montrer, en utilisant un carrousel de vol, que seule Anoga-AKH-I induisait des vols plus performants pendant les premières heures. Après injection de l’Anoga-AKH-I à des femelles, les femelles décapitées ont montré une distance de vol statistiquement supérieure par rapport aux femelles contrôles, alors que les femelles intactes n’ont montré qu’une tendance vers des vols plus performants, sans que cela ne soit statistiquement significatif. En revanche, l’injection d’Anoga-II n'a entraîné aucune différence entre femelles traitées et contrôles. Ceci pourrait indiquer que Anoga-AKH-II ne bloquerait pas Anoga-AKHR et fonctionnerait probablement à travers un autre récepteur.
    Summary
    The main function of adipokinetic hormones (AKHs) is to induce hyperlipaemia an adipokinetic effect, but also hypertrehalosaemia and hyperprolinaemia. This project consists of the identification and characterization, as well as the study of the central metabolic function of AKHs in the main African malaria vector, Anopheles gambiae. By using a combination of bioinformatics and common molecular biological tools, it was possible to characterize two AKH neuropeptides: i.e. the octapeptide, Anoga-AKH-I (pQLTFTPAWa) and the decapeptide, Anoga-AKH-II, (pQVTFSRDWNAa). As members of the AKH-family, both neuropeptides demonstrated two conserved aromatic amino acids at position four and eight. The peptides were blocked at the N- and C-termini by a pyroglutamate (pQ) and amide (a), respectively. Like all neuropeptides, their open reading frame was characterized by the presence of a signal peptide, the hormone (AKH), and the hormone precursor related peptide (APRP). Dissimilarity of both Anoga-AKHs indicates a paralogy from an ancient gene duplication. In comparison to known AKHs, Anoga-AKH-I seems to be closely orthologous to the Drosophila melanogaster AKH (Drome-AKH). Since the fourth AKH in Locusta migratoria (Locmi-HrTH) shares 80% homology with the neuropeptide sequence of Anoga-AKH-II, they probably are orthologs from an ancient ancestor AKH. The gene expression profile of Anoga-AKH-I and -II was constant in eggs, larvae, pupae, and imagos; they were only found in the head and thorax and not in the abdomina. Further analysis of sugar- and blood-fed females presented a similar and constant expression pattern; no changes were detected during the gonotrophic cycle compared to water- and sugar-fed females. In addition, using immunocytochemistry and radioimmunoassays (RIA), the expression was confirmed in the head and thorax only. The main source of Anoga-AKH-I is probably located in the X-cells and thoracic ganglia cells and Anoga-AKH-II in the lateral neurosecretory cells of the protocerebrum. Comparisons between the cellular sources of the octapeptide in D. melanogaster and A. gambiae, demonstrated that in the fruit fly, AKH is only found in the corpora cardiaca, whereas in the mosquito, it is not only in this neurohaemal organ, but is also found in the thoracic ganglia. The staining of the lateral neurosecretory cells was not surprising. Since it is probably the source of the mosquito decapeptide, it underlines the hypothesis that Locmi-HrTH and Anoga-AKH-II are orthologs; both seem to be synthesized in the brain, and not in the corpora cardiaca. Since a few adipokinetic hormone receptors (AKHR) had already been characterized, it was possible to mine for the Anoga-AKHR, by blasting the known AKHR sequences, which resulted in the prediction of a putative Anoga-AKHR that, like all the other AKHRs, belongs to the G-protein coupled receptors (GPCR). Its expression was found in all life stages. The receptor expression pattern did not change during the experimental tests for sugar-fed males and females and during the gonotrophic cycle in females. Since the central function of AKHs is to mobilize nutrients like lipid, carbohydrate, and amino acids, it is predicted that the AKHRs are located in the fat body, which is the main metabolite storage tissue in insects. After splitting the abdomen into ventral and dorsal body walls, digestive tracts, ovaries, and spermatheca, expression was only found in the body parts to which the most fat body were attached. Weak expression was detected in the ovaries, in which surprisingly the unprocessed RNA of Anoga-AKH-I was also found – a possible indication of the involvement of Anoga-AKH-I and Anoga-AKHR during the embryogenesis after oviposition? Anoga-AKH-I induced the mobilization of haemolymph sugar in sugar- and blood-fed females of A. gambiae, and since trehalose is the main haemolymph sugar used in mosquitoes and while no effect on lipid was detected, this neurohormone should be renamed to hypertrehalosaemic hormone, Anoga-HrTH. On the other hand, just like for the fourth locust AKH, no species-specific mobilization of lipid or carbohydrate was detected for mosquito decapeptide. However, Locmi-HrTH elevated the carbohydrate level in the American cockroach, Periplaneta americana, whereas again, no effect was found for Anoga-AKH-II. Similar tests on the lipid level with Anoga-AKH-I and -II in the migratory locust revealed only hyperlipaemia for the mosquito octapeptide. In addition using RNA interference to silence the Anoga-AKHR gene, no hypertrehalosaemia was induced by Anoga-AKH-I treatment after knocking down of the receptor gene expression: an indirect prove that Anoga-AKH-I acts through this GPCR. The whole project was based on the findings that A. gambiae use lipid and carbohydrate during flight. Since it was known that AKHs can mobilize those flight metabolites, as shown in other insects, its influence on flight in A. gambiae was studied. Flight experiments with a flight mill system using intact and decapitated females showed that only Anoga-AKH-I induced a stronger flight performance during the first few hours. Decapitated females revealed a statistically significant boost in distance flown after Anoga-AKH-I injection, whereas in intact females only a trend of stronger flights compared to the control females could be detected. The flight tests with Anoga-AKH-II did not indicate differences from the saline treated females, which could be an indication that Anoga-AKH-II is not blocking the Anoga-AKHR and probably functions through another receptor.