Faculté de biologie et de médecine

Modulation of the epithelial sodium channel by serine proteases

Harris, Michael ; Rossier, Bernard (Dir.) ; Firsov, Dmitri (Codir.)

Thèse de doctorat : Université de Lausanne, 2007.

The epithelial sodium channel (ENaC) is composed of three homologous subunits α, β, and γ. This channel is involved in the regulation of sodium balance, which influences the periciliary liquid level in the lung, and blood pressure via the kidney. ENaC expressed in Xenopus laevis oocytes is preferentially and rapidly assembled into heteromeric αβγ complexes. Expression of homomeric α or... Mehr

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    Résumé
    Le canal épithélial à sodium (ENaC) est constitué de trois sous-unités homologues α, β, and γ. Ce canal est impliqué dans le maintien de la balance sodique qui influence le niveau du liquide périciliaire du poumon et la pression sanguine via le rein. Dans les ovocytes de Xenopus laevis ENaC est préférentiellement et rapidement exprimé en formant un complexe hétéromérique αβγ. En revanche, l’expression homomérique de α ou hétéromérique des complexes αβ et αγ conduit à une expression à la surface cellulaire d’un canal ENaC ne possédant qu’une faible activité. Des études récentes ont mis en évidence que les sous-unités α et γ d’ENaC (mais pas β) sont coupées par des protéases endogènes (les furines) et que ces clivages augmentent l’activité du canal. Nous avons donc analysé, aussi bien à la surface cellulaire que dans le cytoplasme, les produits des clivages de combinaison homo- et hétéromérique des sous-unités d’ENaC (α, β, γ, βγ, αβ, αγ, βγ et αβγ). En parallèle, nous avons étudié l’activité correspondante à ces canaux par la mesure du transport de sodium sensible à l’amiloride (INa). Nous avons montré que lors de l’assemblage des sous-unités d’ENaC, le clivage de γ correspond à l’augmentation de INa. Nous avons également mis en évidence que dans une maladie telle que la fibrose cystique (CF) caractérisée par un déséquilibre de la balance protéase-inhibiteur de protéase, ENaC est suractivé par une sérine protéase nommée élastase (NE). L’augmentation de la concentration de NE clive γ ENaC exprimé à la surface cellulaire (mais pas α, ni β ENaC) suggérant une causalité entre le clivage d’ENaC et son activation à la membrane plasmique. De plus, nous avons démontré que l’inhibiteur de sérine protéase (serpin) serpinH1, qui est co-exprimé avec ENaC dans le néphron distal, inhibe l’activité du canal en empêchant le clivage de la sous-unité γ ENaC. Il est connu que le INa induit par l’aldostérone peut être inhibé par TGFβ. Or TGFβ augmente l’expression de serpinHI. L’inhibition du clivage de γ ENaC et de l’activation du canal par la serpinHI que nous avons mis en évidence pourrait ainsi être responsable de l’effet de TGFβ sur la stimulation du courant par l’aldostérone dans le néphron distal. En résumé, nous avons montré que le clivage de la sous-unité γ, mais pas des sous-unités α et β, est lié à l’activation du canal dans trois contextes distincts.
    Summary
    The epithelial sodium channel (ENaC) is composed of three homologous subunits α, β, and γ. This channel is involved in the regulation of sodium balance, which influences the periciliary liquid level in the lung, and blood pressure via the kidney. ENaC expressed in Xenopus laevis oocytes is preferentially and rapidly assembled into heteromeric αβγ complexes. Expression of homomeric α or heteromeric αβ and αγ complexes lead to channel expression at the cell surface with low activities. Recent studies have demonstrated that α and γ (but not β) EnaC subunits undergo proteolytic cleavage by endogenous proteases (i.e. furin) correlating with increased channel activity. We therefore assayed the full-length subunits and their cleavage products at the cell surface, as well as in the intracellular pool for all homo- and heteromeric combinations (α, β, γ, βγ, αβ, αγ, βγ and αβγ) and measured the corresponding channel activities as amiloride-sensitive sodium transport (INa). We showed that upon assembly, cleavage of the γ ENaC subunit is responsible for increasing INa. We further demonstrated that in disease states such as cystic fibrosis (CF) where there is disequilibrium in the proteaseprotease inhibitor balance, ENaC is over-activated by the serine protease elastase (NE). We demonstrated that elevated NE concentrations can cleave cell surface expressed γ ENaC (but not α, or β ENaC), suggesting a causal relationship between γ ENaC cleavage and EnaC activation, taking place at the plasma membrane. In addition, we demonstrated that the serine protease inhibitor (serpin) serpinH1, which is co-expressed with ENaC in the distal nephron is capable of inhibiting the channel by preventing cleavage of the γ ENaC subunit. Aldosterone mediated increases in INa are known to be inhibted by TGFβ. TGFβ is also known to increase serpinH1 expression. The demonstrated inhibition of γ ENaC cleavage and channel activation by serpinH1 may be responsible for the effect of TGFβ on aldosterone stimulation in the distal nephron. In summary, we show that cleavage of the γ subunit, but not the α or β subunit is linked to channel activation in three seperate contexts.