Faculté des sciences

Effect of sulfur deficiency on the resistance of oilseed rape to fungal pathogens and expression profiling of the glutathione S-transferase family of "Arabidopsis thaliana"

Dubuis, Pierre-Henri ; Mauch, Felix (Dir.)

Thèse de doctorat : Université de Fribourg, 2004 ; no 1442.

The reduction of S02 atmospheric pollution in the early nineties caused sulfur-deficiency problems in the agriculture of northern Europe. Sulfur is essential for plant development and sulfur containing compounds such as sulfur rich antifungal proteins, phytoalexins and glucosinolates play an important role in plant defense against pathogens. Sulfur starved Brassica napus with no visible symptoms... More

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    Résumé
    La réduction de la pollution atmosphérique due au dioxyde de soufre a provoqué au début des années nonante des problèmes de carence de soufre dans les champs principalement au nord de l’Europe. Le soufre est un macroélément essentiel pour le développement de la plante. Des composés soufrés tels que des protéines riches en soufre, des phytoalexines et des glucosinolates, jouent un rôle important dans les mécanismes de défense. Des plants de colza carencés en soufre, mais ne montrant aucun symptôme visible, présentaient une forte réduction de leur teneur en soufre total et en glutathion. Ces plantes montraient aussi une augmentation de leur susceptibilité au pathogène de la nécrose du collet, Leptosphaeria maculans, au nécrotrophe généraliste Botrytis cinerea ainsi qu’à l’oomycète Phytophthora brassicae. Dans le but d’analyser les causes de cette augmentation de susceptibilité nous avons testé le potentiel antifongique d’un extrait protéique et d’un extrait au méthanol contenant des métabolites secondaires. Ces extraits ont été obtenus à partir de colza cultivé avec et sans soufre, et préalablement induit ou non au moyen d’une inoculation avec Botrytis cinerea. L’extrait méthanolique obtenu à partir de plantes normales avait une activité antifongique qui était presque entièrement perdue dans le même extrait obtenu à partir de colza carencé en soufre. Cette perte d’activité antifongique corrélait avec une forte réduction du contenu en glucosinolates de l’extrait. Ceci suggère que la réduction du contenu en glucosinolates pourrait être la cause de la réduction du potentiel antifongique. Toutefois aucun lien de causalité n’a encore pu être démontré. L’affaiblissement général des plantes carencées pourrait aussi jouer un rôle additionnel dans la diminution de leur résistance aux pathogènes fongiques. Le métabolisme secondaire des végétaux contribue significativement à la défense de la plante contre divers stress environnementaux. Pour étudier les changements transcriptionels des gènes d’Arabidopsis thaliana impliqués dans les mécanismes de détoxification nous avons développé un «DNA array» (MetArray) contenant des sondes spécifiques pour chaque membre des familles de gènes impliquées dans les étapes successives de détoxification. Le MetArray contient des sondes pour la totalité des gènes codant pour des glycosyltransférases, pour 63 enzymes utilisant du glutathion ainsi que 62 cytochrome P450 monooxygénases et 28 ABC transporteurs. Leur expression a été analysée dans les différents organes de la plante ainsi que dans les feuilles suite à divers traitements tel que herbicides, irradiation avec des UV-B, hormones endogènes liées à la réponse au stress et infection avec un pathogène. Une analyse en composante principale basée sur le transcriptome de ces familles de gènes détermine des réponses distinctes. Les traitements avec le méthyljasmonate et l’éthylène forment un groupe. Le traitement avec l’acide salicylique deux herbicides sulfonylurée et l’inoculation avec une souche avirulente de Pseudomonas syringae en forment un autre. Enfin la réponse au bromoxynil un herbicide, et le traitement avec des UV-B forment un troisième groupe clairement séparé. Il faut relever un groupe de gènes qui était induit par le pathogène P. syringae mais qui ne montrait aucune réponse aux trois hormones liées aux voies de signalisation. De plus un petit groupe de gènes qui pourrait jouer un rôle dans les mécanismes de défense était régulé par diverses voies de signalisation convergentes. La régulation différenciée des divers gènes contredit l’hypothèse d’une grande redondance fonctionnelle dans ce quatre grandes familles de gènes. Les glutathion S-transférases (GST) sont des enzymes multifonctionnels qui sont codés par une famille de gènes. Le génome d’Arabidopsis thaliana contient 47 glutathion S-transférases. Une GST de la classe phi, GSTF8 (At2g47730) est induite par divers traitements dont le stress oxydatif et possède une forte activité GSHperoxydase. Nous avons montré que GSTF8 était localisée dans le chloroplaste en fusionnant le peptide signal de GSTF8 avec une protéine fluorescente (GFP). Comme GSTF8 est la seule GST présente dans le chloroplaste et qu’elle possède une activité GSH-peroxidase, elle constitue un candidat idéal pour une analyse fonctionnelle. Pour ce faire, une lignée transgénique surexprimant GSTF8 a été produite et un mutant insertionel (T-DNA) a été isolé. Toutefois aucun changement phénotypique n’a été observé aussi bien en croissance normale qu’après traitements avec du peroxyde d’hydrogène et du paraquat, induisant tout deux un stress oxydatif. Ceci indique que GSTF8 n’est soit pas impliqué dans la protection contre le stress oxydatif, soit qu’en plus de GSTF8 d’autres mécanismes contribuent à cette protection.
    Summary
    The reduction of S02 atmospheric pollution in the early nineties caused sulfur-deficiency problems in the agriculture of northern Europe. Sulfur is essential for plant development and sulfur containing compounds such as sulfur rich antifungal proteins, phytoalexins and glucosinolates play an important role in plant defense against pathogens. Sulfur starved Brassica napus with no visible symptoms showed a strong decrease in total sulfur and glutathione content and an increased susceptibility to the blackleg fungus Leptosphaeria maculans, to the generalist necrotroph Botrytis cinerea and to the oomycete Phytophthora brassicae. To test the cause of this increased susceptibility, a methanol extract containing secondary metabolites and a water extract of soluble proteins of plants grown with and without sulfur fertilization were used in fungal growth inhibition tests. MeOH extract of normally grown plants showed strong antifungal activity and this activity was almost totally lost in extracts of S-starved plants. Plants preinoculated with B. cinerea did not contain an increased antifungal potential indicating that phytoalexins do not contribute to this activity. The loss of antifungal activity correlated with a strong reduction of the glucosinolate content of the methanol extract suggesting that the reduced level of glucosinolates might be the cause of the reduction of the antifungal potential. However, no causal link could yet be demonstrated. The general loss of fitness of sulfur-starved plants could play an additional important role in the reduction of resistance. Plant secondary metabolism significantly contributes to defense against adverse environmental cues. To investigate stress-induced alterations at the transcriptional level, a DNA array (MetArray) harboring gene specific probes was established, which combined Arabidopsis thaliana effector gene families encoding enzymes acting consecutively in secondary metabolism and defense reactions. It contained the complete set of genes encoding 109 secondary product glycosyltransferases and 63 glutathione-utilizing enzymes along with 62 cytochrome P450 monooxygenases and 28 ABC transporters. Their transcriptome was monitored in different organs of unstressed plants and in shoots in response to herbicides, UV-B radiation, endogenous stress hormones, and pathogen infection. A principal component analysis based on the transcription of these effector gene families defined distinct responses. Methyl jasmonate and ethylene treatment was separated from a group combining reactions towards two sulfonylurea herbicides, salicylate and an avirulent strain of Pseudomonas syringae. The responses to the herbicide bromoxynil and UV-B radiation were separate from both groups. A few genes were diagnostic in their specific response to two herbicide classes used. Interestingly, a subset of genes induced by P. syringae was not responsive to the applied stress hormones. In addition, small groups of comprehensively induced effector genes may be part of defense mechanisms activated by several converging pathways. The differentiating expression patterns detected by the MetArray provide a framework of information regarding the function of individual genes and argue against widely redundant functions within the large gene families analyzed. Plant glutathione S-transferases are multifunctional enzymes encoded by a large gene family containing 47 members in Arabidopsis thaliana. A member of the Phi class GST, AtGSTF8 (At2g47730), is upregulated by various treatments including oxidative stress and exhibits GSH-peroxidase activity. The chloroplastic localisation of GSTF8 was demonstrated by expressing a fusion protein consisting of the predicted GSTF8 signal pepetide and GFP in transgenic Arabidopsis. Analysis of the GST family indicated that GSTF8 is the only chlorplastic GST in Arabidopsis, making it a promising candidate for functional analysis. To this end, GSTF8 over-expressing transgenic lines were produced and a T-DNA insertion knock out mutant was isolated from the SALK-collection. However, no change in phenotype could be seen under normal growth condition and under conditions of oxidative stresses conditions like treatments with hydrogen peroxide and the herbicide paraquat. This indicates that GSTF8 is either not involved in protection from oxidative stress in chloroplasts or, alternatively, that in addition to GSTF8 other mechanisms contribute to this protection.