Faculté des sciences

Mitochondrial tRNA import in the parasitic protozoon "Trypanosoma brucei" and its consequences on mitochondrial translation

Charrière, Fabien ; Schneider, André (Dir.) ; Linder, Patrick (Codir.)

Thèse de doctorat : Université de Fribourg, 2006 ; no 1544.

The protozoon parasite Trypanosoma brucei is the causing agent of human sleeping sickness. Besides its clinical importance T. brucei is also an excellent model for basic research since it has many unique features. The mitochondrion of T. brucei, for example, lacks tRNA genes. The tRNAs required for mitochondrial translation are therefore encoded in the nucleus and imported from the cytosol [1].... More

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    Résumé
    Le parasite protozoaire Trypanosoma brucei est l’agent pathogène responsable de la maladie du sommeil chez l’homme. En plus de son importance dans le domaine de la lutte contre les maladies tropicales, T. brucei est également un excellent modèle pour la recherche fondamentale car il présente beaucoup de caractéristiques qui lui sont propres. Par exemple, aucun ARN de transfert (ARNt) n’est codé dans le génome mitochondrial. Pour cette raison, les ARNts nécessaires au processus de traduction mitochondriale sont codés dans le noyau, puis importés depuis le cytosol [1]. Ainsi, mis à part l’initiateur ARNtMet et l’ARNtSec, tous les ARNts du trypanosome fonctionnent à la fois dans le cytosol et dans la mitochondrie. Une conséquence importante de l’import mitochondrial des ARNts réside dans le fait que les ARNts utilisés dans la mitochondrie de T. brucei ont une origine évolutionnaire eucaryote. Cependant la mitochondrie provient d’un ancêtre bactérien. C’est pourquoi nous avons voulu étudier comment le système de traduction mitochondriale, qui est de type bactérien, s’est adapté aux ARNts de type eucaryote durant l’évolution. Etant donné que l’initiateur ARNtMet du trypanosome est localisé exclusivement dans le cytosol, le seul ARNtMet présent dans la mitochondrie de T. brucei est l’élongateur ARNtMet qui est importé depuis le cytosol. Dans les bactéries et les organelles, la formylation spécifique de l’initiateur methionyl-ARNtMet catalisée par la methionyl- ARNt formyltransferase (MTF) est nécessaire au processus d’initiation de la traduction. L’initiateur formylmethionyl-ARNtMet résultant de cette réaction se lie alors avec le facteur d’initiation 2 de type bactérien (IF2), ce qui favorise l’intéraction de l’ARNt avec le ribosome. Etonnamment, dans la mitochondrie de T. brucei, une partie de l’élongateur ARNtMet importé est formylée par un orthologue de MTF dont la taille est spécialement grande [2]. Durant ce travail de thèse, nous avons identifié IF2 chez T. brucei et démontré que cette protéine est nécessaire à la croissance normale du parasite. De plus, nous avons montré qu’IF2 ne reconnaît l’élongateur methionyl-ARNtMet que si ce dernier est formylé. Ainsi, en complément de précédentes études [1, 2], ce travail met l’accent sur le double rôle de l’élongateur cytosolique ARNtMet en tant qu’initiateur et élongateur dans un système de traduction mitochondriale (Résultats A). Pour être fonctionnel pendant la traduction, chaque ARNt doit être attaché à son acide aminé. Le processus d’attachement, appelé aminoacylation, est catalisé par des aminoacyl-ARNt synthétases. Etant donné que chez T. brucei les ARNts cytosoliques et importés proviennent du même ensemble de gènes nucléaires, on s’attend à ce qu’ils soient aminoacylés par les mêmes enzymes. Le fait que la plupart des aminoacyl-ARNt synthétases du trypanosome sont représentées par des gènes uniques supporte cette hypothèse. Cependant, le génome du trypanosome contient deux différents gènes codant pour deux tryptophanyl-tRNA synthétases de type eucaryote. Nous montrons dans ce travail que ces deux enzymes sont essentielles pour une croissance normale. De plus nous démontrons que la nécessité d’une deuxième tryptophanyl-tRNA synthétase chez T. brucei est due à l’édition intra-mitochondriale de l’ARNtTrp (tRNA editing) requise pour le ré-assignement du codon UGA en tryptophane (Résultats B). Dans la partie C des résultats, certains composants impliqués dans l’insertion de la sérine et de la sélénocystéine dans les protéines ont été caractérisés. Dans le contexte de l’import mitochondrial des ARNts nous avons montré que l’ARNtSec est le second ARNt localisé exclusivement dans le cytosol du trypanosome. Dans le but d’examiner le rapport entre l’import mitochondrial des ARNts et des protéines chez T. brucei, nous avons utilisé la technique de l’ARN interférence (RNAi) en vue de réduire sensiblement l’expression des homologues de Tim17-22 et Tim8-13. Ces protéines sont connues pour faire partie de l’appareil de translocation des protéines mitochondriales chez d’autres organismes. Les effets morphologiques causés par leur ablation sont présentés dans la partie D des résultats.
    Summary
    The protozoon parasite Trypanosoma brucei is the causing agent of human sleeping sickness. Besides its clinical importance T. brucei is also an excellent model for basic research since it has many unique features. The mitochondrion of T. brucei, for example, lacks tRNA genes. The tRNAs required for mitochondrial translation are therefore encoded in the nucleus and imported from the cytosol [1]. Thus, except for the initiator tRNAMet and tRNASec, all trypanosomal tRNAs function in both the cytosol and the mitochondrion. An important consequence of mitochondrial tRNA import is that the imported tRNAs are of eukaryotic evolutionary origin. The mitochondrion however derives from a bacterial ancestor. Thus, we wanted to investigate how the bacterial-type translation system of the mitochondrion has adapted to eukaryotic-type tRNAs during evolution. Due to the exclusive cytosolic localization of the trypanosomal initiator tRNAMet, the only tRNAMet present in the mitochondrion of T. brucei is the imported eukaryotic elongator tRNAMet. In bacteria and organelles, the translation initiation process requires the specific formylation of the initiator methionyl-tRNAMet by the methionyl-tRNA formyltransferase (MTF). The subsequent binding of the resulting initiator formylmethionyl-tRNAMet to the bacterial-type initiation factor 2 (IF2) promotes the interaction of the tRNA with the ribosome. In the mitochondrion of T. brucei a fraction of the imported elongator methionyl-tRNAMet is unexpectedly formylated by an extraordinary large MTF orthologue [2]. In the present work we identified the trypanosomal IF2 and we demonstrated that it is required for normal growth of the parasite. Furthermore, we showed that it recognizes the formylmethionylated imported elongator tRNAMet, but not its unformylated counterpart. Hence, together with previous studies [1, 2], this work emphasizes the dual use of a cytosolic elongator tRNAMet as initiator and elongator in a mitochondrial translation system (Results A). In order to be used in translation each tRNA needs to be attached to its cognate amino acid. The process of attachment is called aminoacylation and is catalyzed by aminoacyl-tRNA synthetases. Since cytosolic and imported tRNAs of T. brucei derive from the same set of nuclear genes they are expected to be aminoacylated by the same enzymes. In agreement with this hypothesis, most trypanosomal aminoacyl-tRNA synthetases are represented by single genes. Interestingly however, the T. brucei genome contains two different genes for eukaryotic tryptophanyl-tRNA synthetases. We show in this work that both of these enzymes are essential for normal growth. Furthermore we demonstrate that the unexpected use of a second tryptophanyl-tRNA synthetase in T. brucei is caused by a mitochondria-specific editing event of the tRNATrp which is required for the mitochondrial reassignment of the UGA codon to tryptophan (Results B). In the part C of the results section some components involved in the insertion of serine and selenocysteine into trypanosomal proteins were characterized. In the context of the mitochondrial tRNA import it was shown that tRNASec is the second cytosol-specific tRNA in T. brucei. In order to understand the connection between the mitochondrial tRNA import and protein translocation in T. brucei we used the RNA interference (RNAi) strategy to knock down the expression of the Tim17-22 and Tim8-13 homologues. These proteins are known to be components of the mitochondrial protein translocation machinery in other organisms. Morphological effects caused by their depletion are presented in the part D of the results.