Faculté des sciences

Yeast growth selection system for the identification of cell-active inhibitors of human cytomegalovirus protease

Cottier, Valérie ; Müller, Fritz (Dir.)

Thèse de doctorat : Université de Fribourg, 2006 ; no 1501.

Human cytomegalovirus (HCMV) is one of the most common opportunistic infective agents in immunocompromised individuals, such as AIDS patients and organ transplant recipients, and causes the most frequent congenital infection in humans. Existing antiviral treatments are limited by severe drawbacks, i.e. poor bioavailability, toxicity and limited effectiveness mainly due to the development of drug... More

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    Résumé
    Le cytomégalovirus est l’un des agents infectieux les plus communs chez les personnes immunodéficitaires, tels que les malades du SIDA ou les receveurs de greffe. Ce virus cause aussi fréquemment des infections congénitales. Les traitements existants sont limités par des défauts majeurs: mauvaise absorption, toxicité, efficacité restreinte à cause du développement de souches virales résistantes aux médicaments. Il y a donc un évident besoin de nouvelles thérapies. La protéase du cytomégalovirus, responsable de l’assemblage et de la maturation de la capside, est essentielle pour la production de virus infectieux, et représente donc une cible prometteuse pour le développement de nouveaux médicaments. Dans les parties I et II de cette thèse, je décris le développement de deux systèmes de sélection qui mesurent l’activité de la protéase du cytomégalovirus dans la levure. Dans les deux systèmes, l’activité de la protéase est reflétée par un ralentissement de la prolifération cellulaire. Dans le système LexA-M (Partie I), le site de clivage de la protéase est inséré entre le domaine de LexA se liant à l’ADN et le domaine activateur du facteur de transcription Gal4p. Le clivage par la protéase inactive ce facteur de transcription hybride, causant ainsi un arrêt de la transcription du gène rapporteur HIS3. En conséquence, ces cellules ne peuvent pas proliférer dans un milieu sélectif sans histidine. Cependant, l’ajout d’inhibiteurs de protéase au milieu de culture permet l’expression du gène HIS3 et ainsi stimule la croissance cellulaire. Dans le système Trp1-M (Partie II), le site de clivage de la protéase est inséré dans la chaîne polypeptidique de Trp1p, une protéine de levure essentielle à la synthèse du tryptophane. L’inactivation de cette enzyme par la protéase empêche la prolifération cellulaire en milieu sans tryptophane, alors que l’ajout d’inhibiteurs de protéase la relance. Les deux systèmes reposent ainsi sur un read-out positif et donc sélectionnent directement des composés non toxiques. Dans la troisième partie de cette thèse, le système LexA-M a été utilisé pour un screen à large échelle visant à identifier des inhibiteurs de la protéase du cytomégalovirus. Une librairie de 15'000 molécules a été criblée de manière entièrement automatisée. Nous avons obtenu 67 hits qui ont stimulé la prolifération de levures de manière dose-dépendante. Ces 67 hits ont ensuite été évalués par des tests biochimiques et cellulaires. Parmi eux, 8 ont fait preuve de bonnes propriétés antivirales en culture cellulaire, mais l’interaction directe entre ces inhibiteurs putatifs et la protéase n’a pas pu être démontrée.
    Summary
    Human cytomegalovirus (HCMV) is one of the most common opportunistic infective agents in immunocompromised individuals, such as AIDS patients and organ transplant recipients, and causes the most frequent congenital infection in humans. Existing antiviral treatments are limited by severe drawbacks, i.e. poor bioavailability, toxicity and limited effectiveness mainly due to the development of drug resistant viruses. Thus, there is continuous need for new and effective anti-cytomegalovirus agents. The viral protease, which functions during assembly and maturation of the capsid and which is essential for the production of infectious virus, represents a promising drug target. In Parts I and II of this PhD thesis I describe the development of two growth selection systems that monitor HCMV protease activity in yeast cells. In the LexA-M system (Part I) the cleavage site of HCMV protease is inserted between the DNA-binding domain of LexA and the activating domain of the transcription factor Gal4p. Cleavage by the viral protease inactivates the likewise engineered transcription factor, thereby causing a stop in transcription of a downstream cloned LexA-Gal4p regulated HIS3 growth selection gene. Such yeast cells do not grow in selective medium lacking histidine. However, addition of a protease inhibitor allows expression of the HIS3 gene resulting in stimulation of cell growth. In the Trp1-M system (Part II), the HCMV protease cleavage site is inserted in Trp1p, a yeast protein essential for cell proliferation in medium lacking tryptophan. Functional inactivation of this modified Trp1p by the viral protease prevents cell growth, whereas addition of validated protease inhibitors results in stimulation of cell proliferation. Importantly, both systems rely on a positive read-out and therefore directly select for non-toxic compounds. In Part III of this thesis, the LexA-M system was applied to a high-throughput screening (HTS) for the identification of HCMV protease inhibitors. A library of 15’000 small molecules was screened in a fully automated manner. We obtained 67 confirmed hits, which stimulated growth in yeast in a concentration-dependant manner. These 67 hits were further investigated in biochemical and mammalian cell-based assays. 8 of them showed good antiviral properties in cell culture in the 2-digit μM range; however no evidence was obtained for a direct binding to the protease.