Faculté de l'environnement naturel, architectural et construit ENAC, Section des sciences et ingénierie de l'environnement, Institut des sciences et technologies de l'environnement ISTE (Laboratoire de pollution atmosphérique et du sol LPAS)

Clinical fluorescence spectroscopy and imaging for the detection of early carcinoma by autofluorescence bronchoscopy and the study of the protoporphyrin IX pharmacokinetics in the endometrium

Gabrecht, Tanja ; Wagnières, Georges (Dir.)

Thèse sciences Ecole polytechnique fédérale de Lausanne EPFL : 2006 ; no 3537.

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    Summary
    The aim of this thesis is to optimise and gain fundamental information on two applications of photomedicine using fluorescence imaging and spectrofluorometry: (1) the detection of early bronchial cancer by autofluorescence imaging and (2) the endometrial ablation by photodynamic therapy (PDT) based on the use of Protoporphyrin IX (PpIX). Fluorescence imaging and spectroscopy require a fluorochrome localised within the tissue. The fluorochrome can either be endogenous (naturally synthesised in the body), endogenously induced (synthesised in the body from an administered drug), or exogenous (synthesised outside the body). This thesis concentrates on the clinical applications of the endogenous and an endogenously induced fluorochrome (PpIX). Therefore, this work has been divided into two parts according to the type of fluorochromes. The numerous endogenous fluorochromes occur naturally. They are collectively responsible for the fluorescence properties of biological tissues. This tissue's intrinsic fluorescence is also referred to as autofluorescence (AF). The AF of bronchial tissues, change when they become dysplastic or neoplastic. Early neoplastic or dysplastic lesions show an overall decrease in the AF intensity as well as a distorsion of the spectral shape. Endoscopic imaging devices rely on this principle to detect early neoplastic lesions in the tracheo-bronchial tree. The first part of this thesis describes our efforts to improve the performance of AFB and to gather insight into the mechanisms at the origin of the AF contrast in the bronchi. For this purpose, we conducted a number of clinical and ex vivo studies using imaging and spectrofluorometry. Our initial clinical imaging study revealed that the detection of a red background image instead of the red AF image increased the lesion-to-healthy tissue contrast by a factor of 2. This improvement has been implemented in an AFB device that is currently commercialised by the Richard Wolf Endoskope GmbH. In a seperate clinical imaging study we investigated the influence of the excitation wavelength on the AF contrast. Using a narrowband (6 nm FWHM) excitation around 410 nm resulted in a 1.5 times higher lesion-to-healthy tissue intensity contrast than observed with a comparable broadband (80 nm FWHM) excitation. A supplemental study showed that short wavelength blue backscattered light around 430 nm has the potential to discriminate true positive lesions (i.e. early neoplastic lesions detected positive with the AFB system) from false positive lesions (i.e. benign tissue changes detected positive with the AFB system). A spectrofluorometric ex vivo study was performed to gain insight on the mechanisms at the origin of these contrasts. Five principal mechanisms are discussed, namely changes of: (1) the fluorochrome's concentration, (2) the fluorochrome's metabolic status, (3) the fluorochrome's physico-chemical microenvironment, (4) the tissue architecture such as thickening of the epithelium, and (5) the concentration of light absorbing chromophores such as haemoglobin. We measured formalin fixed human bronchial tissue samples with an optical fibre based spectrofluorometer. The formalin fixed bronchial tissue samples showed a general decrease of the AF of early lesions compared to the healthy tissues. However, no distortion of the lesions' AF spectra with respect to that of the healthy tissues was observed. These results were confirmed by imaging of the tissue samples with our AFB system. The observations from these ex vivo studies together with results obtained in clinics with our imaging system lead us to conclude that the AF contrast can be attributed to a combined effect induced by: (1) changes in the architecture of superficial tissues and (2) the concentration and spatial distribution of haemoglobin in the submucosa. Furthermore, we investigated inter-patient variations of the bronchial AF to estimate their impact on the spectral/photonic design of AFB systems. An endoscopic reference with tissue-like optical and spectral properties was designed for this purpose. Surprisingly, the AF intensities in spectroscopy of the human bronchi showed only minor (< 30 %) variations from one individual to another. The exogenously induced fluorochrome Protoporphyrin IX (PpIX) is synthesised from 5-aminolaevulinic acid (5-ALA) in the haeme biosynthetic pathway. PpIX is widely used in PDT and fluoresence detection for both malignant and benign, lesions. The second part of this thesis deals with the pharmacokinetics of 5-ALA induced PpIX in the endometrium. The final goal of this study was the optimisation of the treatment protocol for photodynamic endometrial ablation to treat menorrhagia and hypermenorrhea. The PpIX build-up in the human endometrium was measured in vivo by spectrofluorometry following intra-uterine instillation of 5-ALA. An intra-uterine optical-fibre based probe was designed for this purpose. The PpIX pharmacokinetics showed important inter-patient and intra-patient variations regarding the time interval between the drug instillation and the maximal PpIX fluorescence. Indeed, we have found that this time interval ranges between 0.5 and 5 hours. The maximal measured PpIX fluorescence intensities varied by one order of magnitude from one patient to another. Finally, no correlation was found between the characteristics of the PpIX build-up and the patient's hormonal status.
    Résumé
    L'objectif de cette thèse est d'optimiser et d'approfondir deux applications de photomédecine faisant usage de l'imagerie et de la spectroscopie de fluorescence : (1) la détection précoce du cancer bronchique par imagerie d'autofluorescence et (2) l'ablation de l'endomètre par thérapie photodynamique (PDT) avec l'usage de la protoporphyrine IX (PpIX). L'imagerie et la spectroscopie de fluorescence requièrent un fluorochrome contenu dans le tissu. Le fluorochrome est dit endogène (synthétisé naturellement par le corps), induit de façon endogène (synthétisé par le corps découlant d'une drogue administrée), ou exogène (synthétisé hors du corps). Le sujet de cette thèse est consacré aux applications cliniques des fluorochromes endogènes et induit de façon endogène (PpIX). Dès lors, ce rapport de thèse est divisé en deux parties distinctes selon le type de fluorochrome. De nombreux fluorochromes endogènes sont présents naturellement. Collectivement, ils contribuent aux propriétés de fluorescence des tissus biologiques. Cette fluorescence intrinsèque des tissus est souvent appelée autofluorescence (AF). L'AF du tissu bronchique change lorsqu'il devient néoplasique ou dysplasique. On observe sur toutes les lésions néoplasiques et dysplasiques une forte décroissance de l'intensité d'AF, ainsi qu'une distorsion de la forme spectrale. Ce principe est utilisé dans les appareils d'imagerie endoscopique pour détecter des lésions néoplasiques dans l'arbre trachéo-bronchique. L'objectif de la première partie de cette thèse était d'améliorer la performance de la bronchoscopie en autofluorescence (AFB) et de découvrir les mécanismes prévalant à l'avènement de ces contrastes dans les bronches. Pour cela, nous avons conduit plusieurs études cliniques et ex vivo, faisant usage de l'imagerie et de la spectrofluorométrie. Plusieurs études cliniques utilisant l'imagerie font partie intégrante de ce travail de thèse. Dans la première, nous avons établi que la détection d'une image formée par le rouge rétro-diffusé, en lieu et place d'une image rouge d'AF, permet d'améliorer le contraste d'un facteur 2. Ce dispositif a été implémenté dans l'appareil d'AFB, actuellement commercialisé par Richard Wolf Endoskope GmbH. Dans la deuxième, nous avons étudié l'influence de la lumière excitatrice sur le contraste d'AF. Pour cela, nous avons utilisé une excitation à bande étroite centrée à 410nm et obtenu un contraste lésion-tissu sain 1.5 fois supérieur à celui obtenu avec une excitation à bande large. La troisième étude montra que le bleu à courtes longueurs d'onde (430nm) rétro-diffusé pouvait différencier les lésions vraies-positives (càd. lésions néoplasiques précoces détectées avec l'AFB) des lésions fausses-positives (càd. changements bénins des tissus détectés avec l'AFB). Une étude spectrofluorométrique ex vivo fut réalisée pour comprendre les mécanismes à l'origine des contrastes. Cinq mécanismes principaux seront discutés : (1) la concentration des fluorochromes (2) l'état métabolique des fluorochromes (3) le micro-environnement physico-chimique des fluorochromes (4) la structure du tissu (par ex. l'épaississement de l'épithélium) et (5) la concentration des chromophores absorbants, comme l'hémoglobine. Nous avons mesuré des échantillons de tissus bronchiques fixés en formaline avec un spectrofluoromètre à fibre optique. Ces échantillons ont généralement montré une décroissance de l'AF des lésions précoces en comparaison avec le tissu sain. Pourtant, aucune distorsion ne fut observée entre le spectre d'AF sur les lésions et celui des tissus sains. Ces résultats furent confirmés par l'imagerie des ces échantillons tissulaires avec notre appareil AFB. Les observations de ces études ex vivo, combinées aux résultats obtenus en clinique avec notre système d'imagerie, nous amènent à conclure que le contraste d'autofluorescence peut être attribué à un effet combiné induit par (1) la structure architecturale des tissus superficiels, ainsi que (2) la distribution spatiale et la concentration de l'hémoglobine dans la sous-muqueuse. En outre, nous avons étudié les variations inter-patients de l'AF bronchique pour estimer leur impact sur le design du système AFB. Une référence endoscopique dont les propriétés optiques et spectrales étaient proches de celles du tissu fut construite dans ce but. A notre étonnement, l'intensité et la spectroscopie d'AF a montré uniquement de faibles variations (<30%) d'un individu à l'autre. La protoporphyrine IX (PpIX), fluorochrome induit de façon endogène, est synthétisée à partir de l'acide 5-aminolévulinique (5-ALA) dans la chaîne de biosynthèse de l'hème. PpIX est largement utilisé pour la PDT et la détection de fluorescence des lésions malignes et bénignes. La deuxième partie de cette thèse traite de l'étude pharmacocinétique de la PpIX dérivée de 5-ALA dans l'endomètre. L'objectif de cette étude était l'optimisation du protocole de traitement pour l'ablation photodynamique de l'endomètre pour le traitement de la ménorragie et de l'hyperménorrhée. La hausse de la concentration de PpIX dans l'endomètre humain après l'instillation intra-utérine de 5-ALA fut mesurée in vivo par spectrofluorométrie. Une sonde optique intra-utérine à fibre optique fut construite spécialement pour cette étude. La pharmacocinétique de la PpIX montra d'importantes variations intra- et inter-patients quant aux différences dans la durée entre l'instillation et le maximum de fluorescence dû à la PpIX. En effet, nous avons trouvé que cette durée pouvait varier entre 0.5 et 5 heures. L'intensité maximale de la fluorescence due à la PpIX variait d'un ordre de grandeur d'une patiente à l'autre. En définitive, aucune corrélation n'a été trouvée entre les facteurs de croissance de la PpIX et le statut hormonal des patientes.