Faculté des sciences de base SB, Section de chimie et génie chimique, Institut des sciences et ingénierie chimiques ISIC (Laboratoire d'électrochimie physique et analytique LEPA)

Thiol-targeted microspray mass spectrometry of peptides and proteins through on-line EC-tagging

Dayon, Loïc ; Girault, Hubert (Dir.)

Thèse sciences Ecole polytechnique fédérale de Lausanne EPFL : 2006 ; no 3525.

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    Summary
    Modification strategies targeting specific amino acids in proteins are widespread in proteomic analysis. Cysteine residues have received deep consideration in view of their nucleophilic properties and their occurrence in the proteome. A recently developed micro-electrospray emitter for mass spectrometry was used to electrogenerate species reactive towards specific residues in biomolecules. When spraying L-cysteine in the presence of hydroquinone, the thiol cysteine moiety reacts via a 1,4-Michael addition with the benzoquinone electrochemically generated at the electrode. A series of electrogenerated selective electrophiles based on substituted benzoquinones was characterized as tags for L-cysteine. The rate constants pertaining to the addition of L-cysteine onto the benzoquinones were determined through electrochemical techniques. It was shown that the rate constants are primarily dependent on the electronic nature of the substituents. The apparent tagging extents observed for L-cysteine in microspray mass spectrometry experiments were shown to be highly dependent of the ionization efficiencies of the tag. The on-line mass spectrometric electrochemical tagging (EC-tagging) of cysteine residues was studied for peptides. The EC-tagging was tested with the different hydroquinones on an undecapeptide containing one cysteine residue. Methoxycarbonyl-1,4-hydroquinone was shown to be the most efficient probe and revealed to be suitable to count cysteine units in peptides containing up to three cysteines. The number of cysteines corresponds to the number of characteristic mass shifts observed from the unmodified peptide. The identification of bovine serum albumin and human a-lactalbumin digest samples in a peptide mapping strategy were greatly improved by the application of the EC-tagging technique as post-column treatment. Indeed, the determination of cysteine content in the tryptic peptides provides powerful supplementary information to the masses. The tagging method was applied to the determination of four proteins in a model mixture. In parallel, the microspray emitter was characterized as an electrolysis flow cell for the EC-tagging of peptides. The Levich equation was validated as a first approximation for the calculation of the convection-diffusion limiting current in the device. A finite element simulation of the multi-tagging process of peptides was developed to yield the relative distribution and concentration of tags, untagged and tagged species in the microchannel. The main chemical parameters determining the kinetics of the labelling were assessed and discussed considering the microfluidic aspects of the process. The control of the tagging extent allows the simultaneous mass spectrometric analysis of both the unmodified and of the modified peptide(s). This theoretical work has established the range of optimum conditions for the determination of the number of cysteines in peptides containing up to five cysteine groups. The mass spectrometric EC-tagging of cysteine residues in proteins was studied to probe the cysteine environment. An analytical model was developed to calculate rapidly the tagging extent before the spray event. Experiments with unmodified proteins and their chemically reduced forms have highlighted the strong effect of the cysteine site reactivity on the tagging efficiencies. This study has shown relevant parameters for such on-line electrochemical derivatization / mass spectrometric detection strategies. The chemical derivatization of cysteines by benzoquinone reagents was also investigated. These alkylating reagents revealed efficient for diagonal liquid chromatography to isolate cysteinyl peptides by the retention time shifts due to the hydrophobicity of the tags. The work has demonstrated that the inherent electrochemistry of the electrospray can be employed as post column treatment to derivatize cysteinyl biomolecules. Analytical strategies have been developed to take advantage of this electrochemically-controlled modification.
    Résumé
    Les stratégies de modification spécifique d'acides aminés de protéines sont courantes en analyse protéomique. Étant données ses propriétés nucléophiles et son occurrence dans le protéome, la cystéine est une cible très intéressante. Une source de nébulisation électrospray en spectrométrie de masse a été utilisée pour générer électrochimiquement des espèces réactives pour la cystéine. Cette technique a permis la modification en ligne de la fonction thiol de la L-cystéine par la 1,4-benzoquinone produite par electro-oxydation de la 1,4-hydroquinone présente en solution. Dans ce travail, plusieurs hydroquinones substituées ont été étudiées comme agents inductifs du marquage. Les constantes de vitesse de la réaction d'addition entre la L-cystéine et les benzoquinones substituées ont été déterminées par méthodes électrochimiques. Les valeurs déterminées sont apparues en adéquation avec la nature du substituant. Les avancements apparents de la réaction de marquage qui ont ensuite été évalués par analyse par spectrométrie de masse se sont montrés très dépendants de l'aptitude à la nébulisation des agents de marquage. Le marquage électrochimique en ligne des cystéines avec détection par spectrométrie de masse a été étudié au niveau peptidique avec les différentes hydroquinones substituées. La methoxycarbonyl-1,4-hydroquinone s'est révélée comme le meilleur agent de marquage puisqu'elle a permis de marquer l'ensemble des cystéines de peptides contenant jusqu'à trois cystéines. La détermination du nombre de cystéines présentes dans les peptides est possible grâce au caractère non quantitatif de la méthode. En effet, la présence simultanée du signal du peptide initial et des produits de marquage permet le comptage des cystéines via la détection du déplacement de masse relatif au marqueur. L'identification de l'albumine de sérum bovin et de l'α-lactalbumine humaine par empreinte massique de leurs peptides protéolytiques s'est trouvée améliorée par comptage de leurs cystéines. Cette procédure permettant de restreindre la recherche dans les bases de données de séquence de protéines a également été appliquée à l'identification d'un mélange de quatre protéines. Parallèlement, la nature électrolytique de la source microspray a été soulignée. L'équation de Levich a notamment été vérifiée comme première approximation des courants limites de convection-diffusion correspondants à l'oxydation des hydroquinones à l'électrode de la source de nébulisation électrospray. Une simulation par éléments finis du marquage successif des cystéines dans les peptides a été développée. L'obtention des profils de concentration des agents de marquage, des espèces initiales et marquées le long du canal microfluidique de la source électrospray a permis de dégager les paramètres influençant le processus. Dans la mesure où le contrôle de l'avancement de la réaction est essentiel au comptage des cystéines par spectrométrie de masse, ce travail théorique a établi une gamme de conditions optimales de fonctionnement. Le marquage électrochimique des cystéines dans les protéines a ensuite été réalisé afin de sonder leur environnement. Un modèle analytique a été développé pour le calcul rapide des avancements de marquages attendus en sortie de canal, avant nébulisation électrospray. La comparaison des résultats de marquage d'une protéine et de sa forme réduite a souligné l'influence de la structure 3D de la protéine sur l'accessibilité de l'agent marquant. La modification chimique directe des cystéines libres par des benzoquinones a également été évaluée. Ces agents d'alkylation ont été employés pour l'isolation des peptides avec cystéines par chromatographie diagonale, l'hydrophobicité de l'agent de marquage induisant un déplacement du temps de rétention des peptides cibles. Cette étude a montré que l'électrochimie inhérente au processus d'électrospray pouvait servir à la modification de molécules contenant des cystéines, notamment après séparation par chromatographie liquide. Des stratégies analytiques ont été développées pour tirer avantage de cette modification électrochimiquement induite.