Faculté des sciences de base SB, Section de chimie et génie chimique, Institut des sciences et ingénierie chimiques ISIC (Laboratoire d'électrochimie physique et analytique LEPA)

Controlled protein adsorption for microimmunoassays

Lionello, Andrea ; Girault, Hubert (Dir.)

Thèse sciences Ecole polytechnique fédérale de Lausanne EPFL : 2006 ; no 3419.

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    Summary
    This dissertation addresses the adsorption of proteins in microchannels with the aim of improving the result of an immunoassay. To observe the adsorption of fluorescently labelled immunoglobulins G in laser ablated polymer microchannels, a confocal microscope was built. By optically scanning the specimen, and observing one focal plane at time, this tool allows for a high signal-to-background, which leads to a low limit of detection (10-9 M). A numerical model for the adsorption kinetics of proteins on the walls of a microchannel has been developed using the finite element method (FEM). The model illustrates the adsorption limitation sometimes observed when the microdimensions of these systems induce a global depletion of the bulk solution. A new non-dimensional parameter is introduced to predict the final value of the coverage of any microsystem under static adsorption. A working curve and a criteria (h/KΓmax > 10) are provided in order to choose, for given adsorption characteristics, the value of the volume-to-surface ratio (i.e. the channel height h) avoiding depletion effects on the coverage (relative coverage at least 90% of the theoretical one). Simulations were compared with confocal microscopy measurements of IgG antibody adsorption on the walls of a PET (poly(ethylene terephthalate)) microchannel. The fit of the model to the experimental data show that the adsorption is under apparent kinetic control. Two ways of loading proteins on microchannel surfaces for immunological applications have been analysed with the FEM model: the "stop-flow" and the continuous flow processes. The "stop-flow" method consists of successive static incubation periods where the bulk solution depletes upon the adsorption process. A multi-step "stop-flow" protein coating is studied and compared to a coating under continuous flow conditions. For the "stop-flow", a non-dimensional parameter is here introduced, indicating the adsorbing capacity of the system, by which it is possible to calculate the number of loads necessary to reach the optimum coverage. For the continuous flow, the effects on the adsorption of the kinetic rates, flow velocity and wall capacity have been considered. This study shows the importance of a careful choice of the fluid velocity to minimise the sample waste. For diffusion controlled and kinetics controlled processes, two flow velocity criteria are provided in order to obtain the best possible coverage, with the same amount of sample as with the "stop-flow". Surface modifications have been conceived in order to improve the adsorption and the activity of the physisorbed antibodies. The microchannels have been coated with titania nanomaterials, chosen because of their biocompatible properties. Crystalline and amorphous TiO2 have been used and the adsorption with respect to the native PET was improved by 3 times. A study of adsorption as a function of the pH solution and different ionic strengths has been done in order to infer the forces acting during the adsorption: it was found that hydrophobic forces helped by electrostatic ones occur during IgG adsorption onto titania phases. The "stop-flow" method was employed to coat the TiO2 modified microchannels with the capture antibodies and improve the result of a microimmunoassay. When strong adsorbing phases are used, the limit of detection of the assay was lowered by one order of magnitude. The FEM model was used to obtain the kinetic rates of adsorption and desorption of IgG antibodies on PET with a novel biosensor conceived in this lab, which measures capacitive changes in the surface microchannel while the adsorption takes place. As the FEM model foresees a three-dimension region where the adsorption might take place, it can be used to study the adsorption in TiO2 gels developed in our lab.
    Résumé
    Ce travail de thèse s'interesse à l'adsorption de protéines dans des microcanaux dans le but d'améliorer le résultat d'un immunoassay. Pour observer l'adsorption des immunoglobulines G dans des microcanaux polymériques un microscope confocal a été construit. Cet instrument permet de sectionner optiquement le spécimen, en observant un plan focal à la fois. On obtient ainsi un intense signal par rapport au bruit de fond, ce qui mène à une basse limite de détection (10-9 M). Un modèle numérique pour la cinétique d'adsorption des protéines sur les parois d'un microcanal a été développé en utilisant la méthode des éléments finis (FEM). Le modèle illustre la limitation d'adsorption parfois observée quand les microdimensions de ces systèmes induisent un épuisement global de la solution. Un nouveau paramètre adimensionnel est présenté pour prévoir la valeur finale de la couverture de n'importe quel microsystème sous adsorption statique. Un critère (h/KΓmax > 10) est fournis afin de choisir, pour des caractéristiques données d'adsorption, la valeur du rapport de volume-à-surface (c.-à-d. la taille du canal h) évitant des effets d'épuisement sur la solution (couverture relative au moins 90% que la théorique). Les simulations ont été comparées aux mesures par microscopie confocale de l'adsorption d'IgG sur les parois d'un microcanal en PET (poly(ethylene terephthalate)). L'interpolation du modèle aux données expérimentales prouve que l'adsorption s'effectue sous contrôle cinétique. Deux manières de charger des protéines sur des surfaces de microcanal pour des applications immunologiques ont ensuite été analysées avec le modèle FEM : le "stop-flow" et l'écoulement continu. Le "stop-flow" se compose des périodes successives d'incubation statique où la solution s'épuise via le processus d'adsorption. Une couverture de protéines obtenue par "stop-flow" successifs est étudiée et comparée à une couverture obtenue avec l'écoulement continu. Pour le "stop-flow", un paramètre adimensionnel est présenté. Il permet d'indiquer la capacité adsorbante du système. Il est alors possible de calculer le nombre de charges nécessaires pour atteindre la couverture optimale. Pour l'écoulement continu, les effets sur l'adsorption des constantes cinétiques, de la vitesse d'écoulement et de la capacité de la paroi ont été considérées. Cette étude montre l'importance d'un choix soigneux de la vitesse de la solution afin de réduire au minimum la perte de reactif. Concernant les contrôles diffusionel et cinétique, deux critères pour la vitesse d'écoulement sont fournis afin d'obtenir la meilleure couverture, avec la même quantité de solution qu'avec le "stop-flow". Des modifications de surface ont été conçues afin d'améliorer l'adsorption et l'activité des anticorps adsorbés. Les microcanaux ont été recouverts par des nanomatériaux de TiO2, choisi en raison de leurs propriétés biocompatibles. Les TiO2 cristallin et amorphe ont été employés et l'adsorption dans un microcanal a été améliorée par 3 fois. Une étude de l'adsorption en fonction du pH et des différentes concentrations ioniques a été faite afin d'evaluer les forces agissant pendant l'adsorption. La méthode "stop-flow" a été utilisée pour accrocher des anticorps de capture sur les parois des microcanaux modifiés et pour améliorer le résultat d'un microimmunoassay. Quand des phases adsorbantes fortement sont employées, la limite de la détection de l'analyse a été abaissée par un ordre de grandeur. Le modèle FEM a été employé pour obtenir les vitesses d'adsorption et de désorption des anticorps d'IgG sur de microcanaux en PET, par mesure de capacitance avec un nouvel biodétecteur conçu dans ce laboratoire. Comme le modèle FEM prévoit une région tridimensionnel où l'adsorption pourrait avoir lieu, ce dernier peut être employé pour étudier l'adsorption dans des gels de TiO2 développés au laboratoire.