Faculté de l'environnement naturel, architectural et construit ENAC, Section des sciences et ingénierie de l'environnement (Laboratoire de chimie environnementale et écotoxicologie CECOTOX)

Endocrine disruption in soil invertebrates : assessing multigeneration effects of insect growth regulators on "Folsomia Candida" and developing a toxicoproteomic approach

Campiche, Sophie ; Tarradellas, Joseph (Dir.)

Thèse sciences Ecole polytechnique fédérale de Lausanne EPFL : 2006 ; no 3484.

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    Summary
    In the past years, it has been observed that some compounds present in our environment can disturb the reproduction and development of animals like fishes, birds, or reptiles by interfering with their endocrine system. Indeed, these endocrine disrupting compounds (EDC) can mimic or antagonize the effects of hormones, alter the pattern of synthesis and metabolism of hormones or modify hormone receptor levels. These substances represent a risk for wildlife, and possibly for humans. Up to now, endocrine disruption was mainly evaluated for vertebrates and aquatic organisms and for oestrogeniclike substances. However, soil invertebrates, which play an important role in soil functioning, have rarely been considered. Moreover, as their endocrine system differs substantially from those of vertebrates (estrogens do not seem to regulate endocrine functions in invertebrates), other substances than can mimic invertebrate hormones should be taken into account. In this sense, insect growth regulators (IGR), which are third generation insecticides specially developed to interfere with insect endocrine system, are interesting compounds. These substances are supposed to have a high specificity for insect pest and a low toxicity for non-target organisms. In the first part of this study, the sublethal effects of six IGR (methoprene, fenoxycarb, precocene II, tebufenozide, hexaflumuron and teflubenzuron) were evaluated on the non-target soil arthropod Folsomia candida. The collembola F. candida represents an integral and beneficial part of the soil ecosystem. It is an euedaphic (subsurface) species which plays an important role in soil respiration and decomposition processes and is therefore vulnerable to the effects of soil contamination. This ecologically relevant organism is one of the most appropriate invertebrate test species for the assessment of environmental quality. It is recommended as test organism by the international standard ISO 11267. The 28-days reproduction tests conducted according to this protocol show that F. candida is affected by the chosen IGR. The most toxic compounds were the two chitin synthesis inhibitors, teflubenzuron and hexaflumuron, with an EC50 of 0.05 mg/kg (dw) for teflubenzuron and an EC50 of 0.6 mg/kg for hexaflumuron. These concentrations are probably environmentally relevant (toxicity/exposure ratios <5) and thus show that Collembola population are at risk. Endocrine disruptive damage induced by pollutants are often not detected by classical toxicity test based on acute or chronic exposure as they can be latent and not manifested until later in life (damage can even arise in the second or third generations of individuals). Therefore, multigeneration tests were developed and conducted with the collembola F. candida. Effects of four of the chosen IGR were evaluated on the second generation of collembola according to different types of exposure of the parental generation F0. In the first set-up, the F0 generation was exposed for 28 days to the pollutant. Eggs and juveniles from the F1 generation (generated by the F0) were also in contact with the pollutant. In the second set-up, only the F0 generation was exposed to the compound for 10 days. Neither the eggs nor the juveniles from the F1 generation were exposed to the pollutant. In both cases, the F2 generation was never in contact with the toxic substance. Multigeneration tests conducted show that some of the tested IGR (methoprene and teflubenzuron) have an impact on several generations of collembola, although only the F0 generation was exposed. Moreover, the complementarity of the two experimental set-up (28 days and 10 days) provide important data on the endpoints affected by these compounds which cannot be obtained with classical reproduction or mortality tests. In the second part of this study, as it is established that a specific and consistent protein response is given by organisms exposed to chemical stressors, a toxicoproteomic approach was conducted with F. candida to assess the impact of the chosen IGR on its protein pattern. Two-dimensional gels of F. candida were realized and the protein expression profile of 10-day old juvenile collembola was established. As the reproducibility of the protein pattern was quite good, reference mapping was possible and the protein expression profiles of collembola unexposed and exposed to precocene II and methoprene was compared. Only weak alterations of protein expression were observed. It is possible that the use of pools of whole organisms to realize the 2-D gels have masked some of the induced or repressed proteins. The feasibility to identify collembola proteins by MS analysis was determined. Three proteins were identified but the scores obtained were relatively low, probably because of the lack of homologous sequences in the protein databases. The sequencing of F. candida genome would facilitate further identifications. In conclusion, the classical reproduction and multigeneration tests conducted show that the non-target soil arthropod Folsomia candida is affected by the chosen insect growth regulators at concentrations that are probably close to environmental levels. Moreover, the transgenerational effects of some of these IGR was demonstrated. This can have crucial consequences on the populations of collembola or other non-target soil invertebrates. The disappearance of beneficial soil organisms may affect soil fertility and soil community balance and could lead to serious environmental damage. This should be considered in environmental risk assessment. However, there is no evidence that the observed effects can be considered as endocrine disruption. The elucidation of this question would need molecular approaches. The use of proteomics to obtain a specific response (a "protein expression signature") of F. candida exposed to chemicals seems to be a promising method to acquire early warning response of exposure to identify toxicants in environmental risk assessment. Moreover, as F. candida is a widely used test organism to assess the impact of pollutants in the environment, the obtention of specific protein response to pollutant exposure and in a further time the identification of these proteins would complement the data already available with classical ecotoxicological testing.
    Résumé
    Ces dernières années, on a constaté la présence dans notre environnement de substances ayant la capacité d'interférer avec le système endocrinien des organismes vivants, perturbant ainsi la reproduction et le développement d'animaux tels que les poissons, les oiseaux ou les reptiles. Ces composés, également connus sous le terme de perturbateurs à effets endocrininens, peuvent mimer les effets des hormones, altérer les processus de synthèse et de métabolismes hormonaux ou modifier le niveau des récepteurs hormonaux. Ces substances représentent donc un risque pour l'environnement, la faune et potentiellement pour l'être humain. Jusqu'à présent, la disruption endocrinienne a été principalement étudiée chez les vertébrés et les organismes aquatiques ainsi que pour les substances imitant les oestrogènes. Cependant, les invertébrés du sol qui jouent un rôle prépondérant dans son fonctionnement, n'ont que rarement été pris en considération. De plus, de par le fait que leur système endocrinien diffère substantiellement de celui des vertébrés (les oestrogènes ne semblent pas réguler de fonctions endocriniennes chez les invertébrés), d'autres substances pouvant imiter les hormones des invertébrés doivent également être considérées. Les régulateurs de croissance des insectes, insecticides de "troisième génération" spécialement conçus pour interférer avec leur système endocrinien semblent donc représenter des substances d'intérêt. Ces insecticides sont considérés comme étant hautement spécifiques pour supprimer les insectes nuisibles et faiblement toxiques pour les organismes non-cibles. Dans la première partie de ce travail, les effets subléthaux de six régulateurs de croissance des insectes (le méthoprene, le fenoxycarb, le précocène II, le tébufénozide, l'hexaflumuron et le téflubenzuron) ont été évalués sur un organisme non-cible du sol, l'arthropode Folsomia candida. Le collembole F. candida est partie intégrante et bénéfique de l'écosystème du sol. C'est une espèce euedaphique qui joue un rôle important dans les processus de respiration et de décomposition du sol. Il est donc vulnérable aux effets de contamination des sols. Cet organisme, représentatif pour l'écologie, est l'espèce test d'invertébrés la plus appropriée pour évaluer la qualité de l'environnement. Il est recommandé en tant qu'organisme de test par la norme ISO 11267. Les tests de reproduction "28 jours" conduits selon ce protocole ont montré que F. candida est affecté par les régulateurs de croissance des insectes choisis. Les composés les plus toxiques sont les deux inhibiteurs de la synthèse de la chitine, le téflubenzuron et l'hexaflumuron, avec une EC50 de 0.05 mg/kg pour le téflubenzuron et une EC50 de 0.6 mg/kg pour l'hexaflumuron. Ces concentrations sont proches de celles que l'on pourrait trouver dans l'environnement et indiquent que les populations de collemboles courent un risque. Les dommages relatifs à la disruption endocrinienne induits par des polluants ne peuvent généralement pas être détectés par des tests de toxicité classiques basés sur la toxicité aiguë ou chronique. En effet, ces dommages sont souvent latents et ne se manifestent que tardivement dans un cycle de vie. Ils peuvent même n'apparaître qu'au cours de la deuxième ou troisième génération d'individus. Pour cette raison, il nous a paru important de réaliser des tests multigénérationnels avec le collembole F. candida. Les effets de quatre régulateurs de croissance des insectes ont été évalués sur la seconde génération de collemboles selon différents modes d'exposition de la génération parentale (F0). Dans le premier mode expérimental, la F0 a été exposée durant 28 jours au polluant. Les oeufs et les juvéniles de la génération F1 (générés par la F0) ont également été en contact avec le polluant. Dans le second mode opératoire, seuls les individus de la génération F0 sont exposés au composé toxique pendant 10 jours. Ni les oeufs ni les juvéniles de la génération F1 ne sont exposés au polluant. Dans les deux cas, la génération F2 n'a jamais été exposée à la substance toxique. Les tests multigénérationnels menés ont montré que certains des régulateurs de la croissance des insectes testés (le méthoprène et le téflubenzuron) pouvaient avoir un impact sur plusieurs générations de collemboles, bien que seule la génération parentale (F0) aie été exposée. De plus, la complémentarité des deux modes opératoires (28 jours et 10 jours d'exposition de la F0) permet de fournir des informations importantes sur ces composés. Ces informations ne peuvent pas être obtenues par des tests de reproduction ou de mortalité classiques. Dans la seconde partie de ce travail, une étude de toxicoprotéomique a été conduite avec le collembole F. candida afin d'évaluer l'impact des substances choisies sur son pattern de protéines. En effet, il a été démontré qu'une réponse consistante et spécifique des protéines était fournie par les organismes exposés à des facteurs de stress environnementaux. Des gels d'électrophorèse en deux-dimensions ont donc été établis pour le collembole F. candida. Le profil d'expression de protéines d'individus âgés de 10 jours a été constitué. La reproductibilité du pattern de protéines étant relativement bonne, des cartes de référence protéiniques ont pu être établies, permettant ainsi de comparer les patterns de protéines de collemboles exposés au précocène II et méthoprène. Seules de faibles altérations du profil d'expression des protéines ont été observées. Il n'est pas improbable que le fait d'avoir utilisé un groupe d'organismes entiers pour la réalisation des gels 2D ai pu masquer certaines des protéines induites ou réprimées. La faisabilité d'identifier des protéines de F. candida par spectrométrie de masse a été déterminée. Trois protéines ont pu être identifiées mais les scores obtenus étaient relativement faibles, probablement à cause du manque de séquences homologues dans les bases de données de protéines. Le séquençage du génome de F. candida pourrait faciliter les identifications futures. En conclusion, les tests de reproduction classiques et les tests multigénérationnels réalisés ont permis de démontrer que l'arthropode et organisme non-cible du sol Folsomia candida est affecté par les régulateurs de la croissance des insectes testés, et ceci pour des concentrations probablement proches de celles qui pourraient être retrouvées dans l'environnement. De plus, l'effet transgénérationnel de certaines de ces substances a également été démontré. Ceci pourrait avoir des conséquences dramatiques pour les populations de collemboles et autres invertébrés non-cibles du sol. La disparition d'organismes bénéfiques pour le sol pourrait affecter sa fertilité ainsi que l'équilibre de la communauté du sol, conduisant à de sérieux dommages environnementaux. Il serait judicieux d'en tenir compte lors d'une évaluation du risque environnemental. Cependant, il n'y a pas de preuves que les effets observés soient liés à de la disruption endocrinienne. L'élucidation de cette question nécessiterait des études moléculaires. L'utilisation de la protéomique pour l'obtention d'une réponse spécifique (une "signature des protéines") de F. candida exposé à des substances toxiques semble être une approche prometteuse. Elle permettrait d'acquérir des marqueurs d'exposition précoces pour l'identification de substances toxiques dans une évaluation du risque environnemental. De plus, de par le fait que F. candida est un organisme de test fréquemment utilisé pour évaluer l'impact de polluants sur l'environnement, l'obtention d'un pattern de protéines spécifiques en réponse à une exposition à des substances toxiques et dans un autre temps, l'identification de ces protéines permettrait de compléter les données déjà établies par les tests d'écotoxicité classiques.