Faculté des sciences de base SB, Section de chimie et génie chimique, Institut des sciences et ingénierie chimiques ISIC (Laboratoire de chimie physique des polymères et membranes LCPPM)

Functional characterization of a human odorant receptor

Jacquier, Valérie ; Vogel, Horst (Dir.)

Thèse sciences Ecole polytechnique fédérale de Lausanne EPFL : 2005 ; no 3386.

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    Summary
    Olfaction appears to be mediated by a large family of odorant receptors (ORs) that accounts for ~ 1% of the human genome [1–4]. The functional characterization of these receptors has so far been hindered by their poor functional expression in the plasma membrane of heterologous cells. In order to investigate the problem of inefficient OR membrane targeting, sequential stages in the life cycle of the human OR17-40 were monitored. The modification of the receptor by different tags enabled the direct visualization of its biogenesis and trafficking in HEK293 cells. A multi-color labelling approach, which involved fluorescent subcellular markers as well as the spectral separation of membrane-inserted and intracellularly located receptors, indicated that high overexpression led to the accumulation of the receptor in the ER, whereas low expression levels improved its membrane targeting. To increase the efficiency of OR-mediated signalling, fluorescence-activated cell sorting of a functional OR17-40 – GFP fusion protein was used to separate low from high expressing cells, thus increasing the fraction of odorant-responsive cells up to 80% of the total cell population. Selectively labelled cell surface receptors accumulated over time in intracellular compartments, indicating constitutive receptor internalization. This process, which was independent of receptor activation, occurred along the clathrin-mediated pathway. Moreover, the imaging of single receptors in the plasma membrane indicated that, in absence of ligand, part of the receptors are already confined within small domains of 195 ± 10 nm. This fraction, which increased upon agonist or antagonist binding, probably corresponds to receptors located in clathrin-coated prepits. Odorant molecules structurally related to the cognate agonist helional were tested for their ability to activate OR17-40. It was found that an aldehyde group connected to an aromatic ring via a carbon chain of defined length and containing a methyl group in alpha or beta position is necessary for activating the receptor. In addition, first evidence for an OR17-40-specific antagonism was provided. Finally, OR17-40 activation was monitored in cell-derived native vesicles, opening new ways for assay miniaturization and the development of odorant screenings in a micro-array format.
    Résumé
    Les odeurs seraient transmises au cerveau par une vaste famille de récepteurs olfactifs (ORs) représentant environ 1% du génome humain [1–4]. La caractérisation de ces récepteurs a été jusqu'ici retardée par le faible taux d'expression fonctionnelle dans la membrane plasmique de cellules hétérologues. Dans le but d'étudier le problème du mauvais transport des récepteurs olfactifs à la membrane plasmique, différentes étapes dans la vie du récepteur olfactif humain OR17-40 ont été suivies. La modification du récepteur par l'addition de différents peptides ont permis de visualiser directement sa biogénèse et son adressage à la membrane dans des cellules HEK293. Un marquage multicolore comprenant des marqueurs cellulaires fluorescents ainsi que la séparation spectrale des récepteurs insérés dans la membrane et des récepteurs situés dans le cytoplasme a indiqué qu'une haute surexpression conduit à l'accumulation du récepteur dans le réticulum endoplasmique, alors que le transport du récepteur à la membrane plasmique est meilleur dans les cellules à faible taux d'expression. Pour renforcer le signal induit par le récepteur, le tri de cellules en fluorescence exploitant une chimère fonctionelle OR17-40 - GFP a été utilisé pour séparer les cellules à faible taux d'expression des cellules à haute surexpression, ce qui a permis d'enrichir la fraction des cellules répondant au ligand jusqu'à 80% de la population totale. Il est montré que les récepteurs se trouvant à la membrane plasmique et qui ont été marqués spécifiquement s'accumulent au cours du temps dans des compartiments intracellulaires, indiquant l'internalisation constitutive du récepteur. Ce processus, qui est indépendant de l'activation du récepteur, a lieu par la voie médiée par la clathrine. De plus, l'étude de la diffusion de récepteurs uniques dans la membrane plasmique a indiqué qu'en absence de ligand, une partie des récepteurs est confinée à l'intérieur de domaines de 195 ± 10 nm, qui correspondent probablement à des précurseurs de puits recouverts de clathrine, et que cette fraction augmente après l'addition d'un agoniste ou d'un antagoniste. Des molécules odorantes structurellement similaires à l'agoniste helional ont été testées pour leur capacité à activer OR17-40. Il est montré qu'un groupe aldehyde relié à un cycle aromatique par une chaîne carbonique de longueur définie et contenant un groupe méthyle en position alpha ou beta est nécessaire pour activer le récepteur. De plus, un premier exemple d'antagonisme spécifique à OR17-40 est fourni. Finalement, l'activation d'OR17-40 a été observée dans des vésicules natives produites à partir de cellules, ouvrant la voie à la miniaturisation de tests pour le screening de molécules odorantes.