Faculté des sciences de base SB, Section de chimie et génie chimique, Institut des sciences et ingénierie chimiques ISIC (Laboratoire de chimie physique des polymères et membranes LCPPM)

Dynamics of the 5-HT3A serotonin receptor in living cells

Guignet, Emmanuel ; Vogel, Horst (Dir.)

Thèse sciences Ecole polytechnique fédérale de Lausanne EPFL : 2005 ; no 3384.

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    Summary
    The 5-HT3 serotonin receptor belongs to the cys-loop ligand-gated ion channel (LGIC) family. It is located in the central and peripheral nervous system and is implicated in certain pathologic situations. The 5-HT3 receptor is investigated here, as a typical example of these LGIC's, to elucidate its structure and dynamics in living cells. Distribution, receptor-ligand interaction and low-resolution structural information of the 5-HT3 receptor were determined using a new method for protein labelling (chapter 2). This generic method does not require the fusion of bulky fluorophores or other moieties to the target molecule. Instead, small nickel-chelating nitrilotriacetate probes are used that bind specifically and reversibly to polyhistidine loops on the target proteins. The lateral mobility of the 5-HT3 in different functional states was investigated by single-molecule microscopy using the newly developed repetitive protein labelling method (chapter 3). A significant reduction of the lateral mobility of the desensitized receptor was observed indicating the role of serotonin in modulating the diffusion of the receptor, which might be important in the development of the synapse. Conformational transitions of the 5-HT3 receptor were investigated by tethering a fluorophore to a single cysteine side chain introduced at the 20' position in the TM2 region (chapter 4). During serotonin application, fluorescence decreased by ~18% indicating a change of the fluorophore environment. Eighteen single cysteine receptors were characterized for functionality and cysteine accessibility. Finally, electrical current through single activated 5-HT3 mutant receptors was measured (chapter 5). Five different conductance levels were determined and noise analysis of current fluctuations in the open states of the activated receptor revealed a 1/fα dependence with α < 1. According to a proposed model, the oscillating domain responsible of the current fluctuations contains charged amino acids. These results contribute to a more comprehensive model of the dynamics both of the 5-HT3 receptor and 5-HT3 receptor within cells.
    Résumé
    Le récepteur de la sérotonine 5-HT3 appartient à la famille des canaux ioniques activés par un ligand de type cys-boucle. Il est localisé dans le système nerveux central et périphérique, et est impliqué dans différentes pathologies. Le récepteur 5-HT3 est utilisé ici comme exemple typique de ces canaux ioniques activés par un ligand pour élucider sa structure et sa dynamique dans des cellules vivantes. La distribution, l'interaction ligand-récepteur ainsi que des informations structurelles à faible résolution ont été déterminées en utilisant une nouvelle méthode de marquage de protéines (chapitre 2). Cette méthode générique ne requiert pas la fusion de fluorophores volumineux à la molecule d'intérêt. De petites sondes de nitrilotriacetate chélatant du nickel suffisent à lier de manière spécifique et réversible les boucles de polyhistidines de la molécule d'intérêt . La mobilité latérale du 5-HT3 dans différents états fonctionnels a été étudiée par microscopie de molécule unique en utilsant la nouvelle méthode de marquage répétitif de protéines (chapitre 3). Une diminution significative de la mobilité latérale du récepteur désensibilisé a été observée indiquant le rôle de la sérotonine comme modulateur de la diffusion du récepteur, ce qui doit être important dans le développement des synapses. Les transitions conformationnelles du récepteur 5-HT3 ont été étudiées en attachant un fluorophore à la chaîne latérale d'une cystéine unique introduite à la position 20' du second segment transmembranaire (chapitre 4). Pendant l'application de sérotonine, la fluorescence a diminué de 18% indiquant un changement de l'environnement du fluorophore. Dix-huit récepteurs contenant une seule cystéine ont été caractérisés pour leur fonctionnalité et l'accessibilité de la cystéine. Finallement, le courant électrique traversant un seul mutant du récepteur 5-HT3 a été mesuré (chapitre 5). Cinq niveaux différents de conductance ont été déterminés et l'analyse de bruit des fluctuations de courant dans les états ouverts du récepteur activé a indiqué une dépendance du bruit de 1/fα avec α < 1. Selon un modèle proposé, le domaine d'oscillation responsable des fluctuations de courant contient des acides aminés chargés. Ces résultats contribuent à un modèle plus complet de la dynamique du récepteur lui-même ainsi que la dynamique du récepteur dans les cellules.