Faculté des sciences de base SB, Section de chimie et génie chimique, Institut des Sciences et Ingénierie Chimiques ISIC (Laboratoire de génie chimique et biologique LGCB)

Characterization of the mechanism of action of spin-filters for animal cell perfusion cultures

Vallez-Chetreanu, Florentina ; Marison, Ian William (Dir.) ; Stockar, Urs von (Dir.)

Thèse sciences Ecole polytechnique fédérale de Lausanne EPFL : 2006 ; no 3488.

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    Summary
    The growing demand for high levels of recombinant proteins of medical and pharmaceutical interest stimulates the development of cell bioprocess technology. Spin-filter technology is employed in order to reach high levels of such compounds. The aim of this thesis was to characterize the mechanisms of cell retention, as well as filter fouling during animal cell spin-filter perfusion cultures. A good understanding of these mechanisms would allow a good optimization of spin-filter parameters and culture conditions in order to achieve high cell density cultures at large scale operation and for long-time and thus increase proteins productivity. The first part of the thesis was focused on the study of particle retention as a function of four main parameters: filter pore size, filter rotation speed, perfusion rate and particle concentration, during perfusion simulations of agarose beads of 13 μm in diameter. Bead retention by filters with pore sizes of 13 and 14.5 μm, larger than the mean particle diameter was found to be dependent mainly on the filter rotation velocity and filter pore size. Filter retention followed a saturation dynamics with an initial direct correlation with respect to filter rotation rate. A plateau was reached above a filter tangential velocity of 0.45 m/s and 0.87 m/s for filters with pore size of 13 and 14.5 μm respectively. The lower the filter velocity was, the greater the influence of perfusion rate on bead retention, whereas the retention was slightly improved when the particle concentration was increased. The presence of a draft tube around open spin-filters was observed to lower the retention, with the effect being greater for non-porous than for porous draft tubes. In the second part of this work, a prediction of radial particle migration near the surface of rotating filter was developed. The lift force was demonstrated to be important in the spin-filter system since it contributes to particle removal from the filter surface. Competition between centrifugal sedimentation, lift forces, Stokes drag and perfusion forces were found to be responsible for determining particle motion relative to the filter. At certain filter rotation rates, centrifugation and lift forces are sufficiently high as to balance perfusion flow and result in the movement of particles away from the filter, a situation that experimentally was found to correspond to maximum particle retention. The model also revealed that filter acceleration is the key parameter to be conserved from small to large scale in order to achieve similar retention rates. This hypothesis has been confirmed experimentally. Then spin-filter cell retention was modeled using response surface methodology. A second-order polynomial model was used to predict the effects of the filter pore size, cell concentration, perfusion capacity and filter acceleration on cell retention. The retention rates obtained experimentally during two different spin-filter perfusion cultures of CHO SSF3 agreed with those predicted by the model, indicating the applicability of the model to animal cell perfusion culture. In the last part of this work the study of filter fouling during long-term perfusion simulations with CHO animal cells was investigated. It was demonstrated that at low filter acceleration, below 6.2 m/s2, a high perfusion rate of 25 cm/h induced rapid filter pore, whereas increasing the filter acceleration to 25 m/s2 increased filter longevity eight times, for filters with a pore size of 8.5 μm. Increasing the filter pore size to 14.5 μm improved filter longevity by 84% and revealed less viable and dead cell deposits on filter surface. Ultrasonic technology was used to reduce filter fouling. Filter vibration, induced by a piezo actuator, improved filter longevity by 113% during real CHO perfusion culture. This work allowed a better understanding of the mechanism of action of spin-filters. The cell retention model developed in this study permits to choose the optimal acceleration at which the filter, of a certain pore size has to be operated in order to achieve similar retention rates for small scale as well as for large-scale processes. The ultrasonic technology through the use of piezoactuators was demonstrated to be a powerful technique for the on-line reduction of filter-fouling, during animal cell perfusion cultures.
    Résumé
    La demande croissante en quantités élevées de protéines recombinantes, d'intérêt médical et pharmaceutique, produites par des cellules animales, stimule le développement de la technologie des bio-procédés cellulaires. Une des technologies qui permet d'atteindre des niveaux élevés de production de tels composés est le filtre tournant. Le but de cette thèse a été de caractériser les mécanismes de rétention cellulaire et de colmatage des filtres lors de cultures de cellules animales, en utilisant le filtre tournant pour le recyclage continu des cellules. Une bonne compréhension de ces mécanismes permettrait une meilleure optimisation des paramètres opérationnels du filtre tournant, pour la réalisation de cultures à haute densité cellulaire à grande échelle et à longue durée, afin d'atteindre une haute productivité de protéines. La première partie de cette thèse se concentre sur l'étude de la rétention de particules en fonction de quatre paramètres principaux: la taille des pores du filtre, la vitesse de rotation du filtre, le taux de perfusion et la concentration de particules, lors de simulations de recyclage de billes d'agarose de 13 μm de diamètre. La rétention des billes par des filtres avec des tailles de pore de 13 et 14.5 μm, plus grandes que le diamètre moyen des particules, s'est avérée dépendre principalement de la taille des pores ainsi que de la vitesse de rotation du filtre. Le profil de la rétention en fonction de la vitesse de rotation du filtre suit comme une dynamique de saturation. Un plateau est atteint au-dessus d'une vitesse tangentielle de filtre de 0.45 m/s et de 0.87 m/s pour des filtres avec une taille de pores de respectivement 13 et 14.5 μm. Plus la vitesse de rotation de filtre est basse et plus l'influence du taux de perfusion sur la rétention des billes est élevée, alors que celle-ci a été légèrement améliorée lorsque la concentration de particules a été augmentée. Il a été observé que la présence d'un tube, faisant office de chicane et placé autour du filtre tournant d'une taille de pores supérieure au diamètre des particules diminue la rétention de celles-ci. L'effet est plus grand pour des tubes non-poreux que pour des tubes poreux. Dans la deuxième partie de ce travail un modèle, qui prédit la migration radiale de particules près de la surface du filtre tournant, a été développé. La force d'ascenseur ou "lift force" a été démontrée être importante dans le mécanisme de rétention des filtres tournants, car elle contribue au déplacement de particules de la surface filtrante. La compétition entre la force centrifuge, la force d'ascenseur, la force de traînée ainsi que celle de perfusion s'est avérée responsable de la détermination du mouvement des particules par rapport au filtre. À des vitesses de rotation du filtre suffisamment élevées, la centrifugation et la force d'ascenseur sont suffisamment importantes pour contrebalancer l'effet de la perfusion, ceci ayant pour résultat l'éloignement des particules de la surface du filtre. Dans ces conditions, une rétention maximale des particules par le filtre a été observée expérimentalement. Le modèle a également indiqué que l'accélération du filtre est le paramètre principal à conserver de petite à grande échelle, afin d'obtenir des taux de rétention similaires, une hypothèse qui a été confirmée aussi expérimentalement. Afin de pouvoir définir les paramètres optimaux du filtre tournant, à n'importe quelle échelle, la rétention de particules a été modélisée en utilisant la méthodologie des surfaces de réponse. Un polynôme de second ordre décrit les effets de la taille des pores du filtre, de la concentration en particules/cellules, de la capacité de perfusion et de l'accélération du filtre, sur la rétention. Les rétentions obtenues expérimentalement lors de deux différentes cultures de cellules CHO avec recyclage de cellules à l'aide du filtre tournant ont corrélé avec ceux prévus par le modèle, indiquant l'applicabilité du modèle à la rétention de cellules animales. Dans la dernière partie de ce travail, le colmatage du filtre tournant a été étudié lors de simulations de cultures continues de longue durée avec recyclage de cellules animales CHO. Il a été démontré qu'à basse accélération du filtre (6.2 m/s2), un taux élevé de perfusion (25 cm/h) induit une obstruction rapide des pores, alors qu'une augmentation de l'accélération du filtre (25 m/s2) augmente de huit fois la longévité du filtre, pour des filtres avec une taille petite des pores (8.5 μm). L'augmentation de la taille des pores (14.5 μm) a amélioré la longévité du filtre de 84% et a révélé un dépôt moindre de cellules viables et mortes sur la surface du filtre. La technologie ultrasonique a été utilisée afin de réduire l'encrassement des filtres tournants. La vibration du filtre, induite par un piézoélectrique a permis d'améliorer la longévité du filtre de 113% pendant une culture continue avec recyclage de cellules CHO. Ce travail a permis une meilleure compréhension du mécanisme d'action des filtres tournants. La modélisation de la rétention des cellules par le filtre tournant permet de définir l'accélération optimale à laquelle le filtre, d'une certaine taille de pore, doit être utilisée de manière à obtenir des taux similaires de rétention lors de son fonctionnement à petite et grande échelle. Le système piézoélectrique s'est avéré à l'utilisation être une technique puissante pour la réduction en ligne de l'encrassement des filtres, lors de cultures de cellules animales.