Faculté des sciences de base SB, Section de chimie et génie chimique, Institut des sciences et ingénierie chimiques ISIC (Laboratoire d'électrochimie physique et analytique LEPA)

Microfluidic front-end technologies for protein electrospray mass spectrometry

Lion, Niels ; Girault, Hubert (Dir.)

Thèse sciences Ecole polytechnique fédérale de Lausanne EPFL : 2006 ; no 3462.

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    Summary
    In the present work, a polymer microfabricated microsprayer is characterised and tested for the mass spectrometric analysis of biomolecules, in particular in the context of protein mass spectrometry and proteomics. As the core of this work deals with analytical sciences and device development, Chapter 1 puts this work in perspective with the emergence of proteomics and more generally systems biology. In particular, major epistemological concepts that allowed the emergence of these new disciplines among life science research are reviewed. It is shown that the new paradigm of integrative biology did not emerge ex nihilo, but was preceded by major epistemological shifts in medicine, physics, and engineering. As such, the rise of systems biology appears as a new episode in the balance between reductionist and holistic approaches in the history of biology and medicine, and its biomedical promises are discussed. Chapter 2 reviews the state of the art in the hyphenation of microfluidic devices with electrospray mass spectrometry, both from a technical and applicative standpoint. Chapter 3 and 4 present the characterisation of the new polymer microspray for the analysis of peptides, proteins and glycoconjugates when coupled with various electrospray ion sources and instruments. In particular, a detailed comparison with classical pulled nanospray capillaries is performed, that established the performances in terms of sensitivity, stability and applicable ranges of flow rates and solvents. Chapter 5 introduces a functionalised polymer microspray for online sample clean-up. Basically, a hydrophobic polyvinylidene fluoride membrane is interfaced at the inlet of the polymer microspray to serve as a capture solid-phase of hydrophobic compounds; once captured, they can be cleaned up, and further eluted by the spray solution containing organic solvents. The process is further investigated in the presence of compounds usually used in protein sample preparation, such as chaotropes, reducing agents or detergents. Further microchip developments include the introduction of a dual channel microsprayer in Chapter 6, that allows to spray two solutions at the same time; given the microchip design, the two solutions are mixed only in the Taylor cone, where the electrospray is generated, and their respective flow rates can be controlled independently. This unique feature allows to analyse pure aqueous samples with integration of minimum amounts of organic sheath flow to promote desolvation and ionisation. Moreover, when proteins are analysed, it allows to measure them in their folded state, as demonstrated by their charge state distribution in the mass spectrum. Further tuning of the organic sheath flow allows to denature the protein within the Taylor cone, which can be monitored by the evolution of the protein charge state distribution in the mass spectrum. Potential of this technology for protein thermodynamic stability measurement is discussed. Lastly, Chapter 7 presents in silico evaluation of two technologies developed in the laboratory, namely Off-Gel electrophoresis for isoelectric fractionation of proteins and peptides mixtures, and online counting of cysteine residues within peptides during their analysis by electrospray mass spectrometry, to provide useful information to speed-up proteome profiling: if one wants to seek within a whole digested proteomes for peptides that are unique, measurement of their mass alone is hardly sufficient to perform useful protein identification, even with very high resolution, high mass accuracy instruments. The purpose of these simulations is to estimate how much information peptide isoelectric point and number of cysteines within each peptide provide in terms of number of unique peptides (and hence unambiguous peptide identification without MS/MS). Applicability of this strategy for high-throughput proteome profiling and its limitations are further discussed.
    Résumé
    L'objet de ce travail est de tester et caractériser un système microfluidique d'électronébulisation pour l'analyse de biomolécules par spectrométrie de masse, et plus particulièrement dans un contexte d'analyse protéomique. Etant donné que ce travail est essentiellement analytique et technologique, le Chapitre 1 décrit le contexte épistémologique qui a vu l'émergence de la protéomique et de la biologie systémique. Il est démontré que ce nouveau paradigme n'est pas apparu ex nihilo, mais est le résultat de basculements épistémologiques majeurs en médecine, physique et ingénierie. Par ailleurs, ce changement paradigmatique s'inscrit dans la longue histoire des luttes entre conceptions holistes et programmes réductionnistes en biologie et médecine. Finalement, le potentiel biomédical de la biologie systémique est discuté. Le Chapitre 2 présente l'état de l'art dans le couplage de systèmes microfluidiques à la spectrométrie de masse par électronébulisation, tant du point de vue technologique qu'applicatif. Les Chapitres 3 et 4 présentent la caractérisation du nouveau micro-électronébulisateur polymère pour l'analyse de peptides, protéines et glycoconjugués sur différents instruments. En particulier, une comparaison détaillée est faite avec des nano-électronébulisateurs capillaires pour préciser les performances du nouveau système en termes de sensibilité, de stabilité, de gamme de débits applicables et de compatibilité avec les solvants organiques. Le Chapitre 5 introduit un micro-électronébulisateur fonctionnalisé pour la purification d'échantillons. En résumé, une membrane hydrophobe de fluoride de polyvinylidène est interfacée à l'entrée du micro-électronébulisateur polymère pour servir de phase solide de capture de composés hydrophobes ; une fois capturés, ces composés peuvent être lavés, puis élués par la solution d'électronébulisation qui contient des solvants organiques. Ce procédé est également évalué lorsque l'échantillon de départ contient des composés courants en préparation d'échantillons protéiques, tels que chaotropes, agents réducteurs, ou détergents. Le Chapitre 6 décrit un développement plus important du système microfluidique lui-même, qui permet d'électronébuliser deux solutions en même temps ; de par la conception du microsystème, les deux solutions ne se mélangent que dans le cône de Taylor, où l'électronébulisation a lieu, et les débits des deux solutions peuvent être contrôlés indépendamment. Cette particularité unique permet d'analyser des échantillons purement aqueux, en intégrant un minimum de solvant organique pour permettre la désolvatation et l'ionisation dans de bonnes conditions. De plus, des protéines peuvent être analysées en conditions natives, comme l'atteste leur distribution de charge dans le spectre de masse. En jouant sur le débit de solvant organique injecté directement dans le cône de Taylor, on peut induire une dénaturation en ligne de la protéine analysée, et suivre cette dénaturation par l'évolution de son état de charge dans le spectre de masse. Le potentiel de cette technologie pour la caractérisation de la stabilité thermodynamique de protéines est discuté. Finalement, le Chapitre 7 présente une évaluation in silico de l'intérêt de deux technologies développées au laboratoire : l'électrophorèse Off-Gel pour le fractionnement isoélectrique de peptides et protéines, et le comptage en ligne des cystéines contenues dans des peptides lors de leur analyse par spectrométrie de masse, pour l'analyse protéomique rapide. Si l'on recherche dans un protéome entier digéré par protéolyse les peptides uniques, la mesure de leur masse seule, même avec un spectromètre à très haute résolution et à très haute précision en masse, ne permet pas d'obtenir des identifications de protéines utiles. Le but de ces simulations est d'évaluer dans quelle mesure l'ajout de l'information sur le point isoélectrique de tous les peptides, ainsi que de leur contenu en cystéines, à la mesure de leur masse, permet d'envisager des mesures protéomiques haut-débit.