Faculté des sciences

On the role of chloroplast plastoglobule lipoprotein particles vitamin E biosynthesis

Vidi, Pierre-Alexandre ; Kessler, Felix (Dir.)

Thèse de doctorat : Université de Neuchâtel, 2006 ; 1881.

Chloroplasts contain lipoprotein particles termed plastoglobules. Plastoglobules are generally believed to have little function beyond lipid storage. However, increased plastoglobule size and number has been correlated with oxidative stress conditions indicating dynamic behaviour. Structural proteins from the PAP/fibrillin family are associated with plastoglobules and are upregulated under... More

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    Résumé
    Les chloroplastes contiennent des corps protéo-lipidiques connus sous le nom de plastoglobules. Les plastoglobules ont longtemps été considérés comme des sites de stockage de lipides. Cependant, des études ont montré que leur nombre et leur volume augmente dans des situations de stress oxydatif. Ces structures ont donc un comportement dynamique. Des protéines structurelles appartenant à la famille des PAP/fibrillines, sont associées aux plastoglobules et leur expression est positivement régulée par plusieurs types de stress environnementaux. Nous avons identifié AtPGL35, une protéine marqueur pour les plastoglobules dans la plante Arabidopsis thaliana, et montré que la synthèse de cette protéine est induite par divers stress oxydatifs. En parallèle, des observations microscopiques ont montré une augmentation de la taille des plastoglobules dans des chloroplastes exposés à un stress oxydatif. Dans le dessein de découvrir de nouveaux composants et de nouvelles fonctions des plastoglobules, un extrait protéique issu de plastoglobules purifiés a été analysé par spectrométrie de masse. Les peptides identifiés appartenaient à des PAP/fibrillines ainsi qu’à des enzymes dont la tocopherol cyclase (AtVTE1), catalysant la pénultième étape de la biosynthèse de l’-tocopherol (la vitamine E). De plus, un fort enrichissement en tocophérols a été mesuré dans les plastoglobules. Des résultats suggérant que AtVTE1 est la seule enzyme de la voie de synthèse des tocophérols à être localisée dans les plastoglobules sont présentés. La présence de AtVTE1 en association avec les plastoglobules indique que ces corps lipidiques ne sont pas uniquement des sites de stockage, mais qu’ils participent à la synthèse de la vitamine E. Actuellement, les protéines recombinantes destinées à la médecine et à l’industrie sont principalement produites par des microorganismes ou des cultures de cellules animales. Dans l’optique de limiter les coûts de production et les risques liés aux pathogènes dans les systèmes animaux, les plantes représentent une alternative intéressante ("l’agriculture moléculaire"). Si la production de matériel végétal est peu coûteuse, les étapes de purifications sont un obstacle pour cette technologie. Afin de simplifier les procédures de purification, nous proposons de tirer parti de la faible densité des plastoglobules pour une première étape d’enrichissement. Comme preuve de principe, nous avons généré des plantes exprimant la protéine fluorescente jaune (YFP) fusionnée à une PAP/fibrilline. La protéine chimérique a été localisée dans les plastoglobules des plantes transgéniques et a pu être fortement enrichie par une simple centrifugation sur gradient. L’accumulation de la protéine recombinante n’a pas eu de conséquence néfaste apparente pour les plantes. Ces résultats démontrent que les plastoglobules représentent un site d’adressage prometteur pour l’agriculture moléculaire.
    Summary
    Chloroplasts contain lipoprotein particles termed plastoglobules. Plastoglobules are generally believed to have little function beyond lipid storage. However, increased plastoglobule size and number has been correlated with oxidative stress conditions indicating dynamic behaviour. Structural proteins from the PAP/fibrillin family are associated with plastoglobules and are upregulated under various environmental stresses. We have identified AtPGL35 as an Arabidopsis thaliana plastoglobule marker protein, and shown that its upregulation under oxidative stress conditions parallels increase of plastoglobule size in chloroplasts. In order to discover new components and functions of plastoglobules, proteins from purified Arabidopsis plastoglobules have been identified by tandem mass spectrometry. The identified peptides belonged to PAP/fibrillins and to known metabolic enzymes including the tocopherol cyclase (AtVTE1), catalysing the penultimate step of  tocopherol (Vitamin E) biosynthesis. In addition, plastoglobules were shown to be a major site of -tocopherol accumulation. The data presented suggest that the cyclase reaction is the only step of the -tocopherol biosynthesis pathway occurring in plastoglobules. Association of AtVTE1 with plastoglobules indicates that these lipid-bodies are not mere storage sites for tocopherols but that they are involved in their synthesis. Plants are emerging as cost-effective alternatives for the production of recombinant proteins. Extraction and purification of transgene products are however obstacles for so-called molecular farming. We propose to take advantage of the low-density of plastoglobules for efficient recovery of recombinant proteins. As a proof-of-concept, the yellow fluorescent protein (YFP), fused to an Arabidopsis PAP/fibrillin, was targeted to plastoglobules and purified by a simple gradient flotation centrifugation procedure. Accumulation of the recombinant protein had no apparent effect on plant viability. These results identify plastoglobules as a promising sub-organellar compartment for molecular farming.