Faculté des sciences

Analysis of pathogen-induced glutathione S-transferases in Arabidopsis thaliana and a gene related to systemic acquired resistance in cucumber (Cucumis sativus L.)

Lieberherr, Damien ; Métraux, Jean-Pierre (Dir.)

Thèse de doctorat : Université de Fribourg, 2001 ; no 1338.

Dans leur environnement naturel, les plantes sont exposées en permanence à une grande variété de microorganismes dont certains sont pathogènes. Ainsi, les plantes ont développé au cours de l’évolution des mécanismes de défense multiples et complexes, qui leur permettent de résister à la plupart des microbes pathogènes. La résistance peut s’exprimer localement au site... Plus

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    Résumé
    Dans leur environnement naturel, les plantes sont exposées en permanence à une grande variété de microorganismes dont certains sont pathogènes. Ainsi, les plantes ont développé au cours de l’évolution des mécanismes de défense multiples et complexes, qui leur permettent de résister à la plupart des microbes pathogènes. La résistance peut s’exprimer localement au site d’infection et systémiquement selon la nature des agents infectieux. Par exemple, suite à une infection par un agent pathogène provoquant des nécroses, la résistance se développe dans toute la plante y compris dans les tissus éloignés du site initial d’infection. Cette forme de résistance, appelée résistance systémique acquise (SAR), se caractérise par l’accumulation locale et systémique de l’acide salicylique (SA) qui agirait sur une activation concomitante de gènes associés à une défense contre certains microbes. Le SA semblerait jouer le rôle de régulateur endogène. En outre, deux hormones végétales, l’acide jasmonique (JA) et l’éthylène sont indispensables à l’activation d’une autre série de gènes impliqués dans la protection contre d’autres agents pathogènes. A l’heure actuelle, de nombreux chercheurs s’efforcent de répertorier les gènes associés à la défense induite et caractériser les fonctions de leurs produits. A part une résistance déployée directement contre les agents pathogènes, les plantes ont aussi développé des mécanismes qui contribuent à restreindre localement les nécroses, sans pour autant affecter directement la prolifération microbienne. Ces mécanismes de protection restent cependant peu étudiés. En premier lieu, nous avons analysé l’expression de deux membres de la super-famille des glutathion S-transférases (GST), AtGSTF2 et AtGSTF6, chez des plantes d’Arabidopsis thaliana inoculées avec une souche avirulente de Pseudomonas syringae. Les deux gènes étudiés sont fortement et rapidement induits après inoculation avec un agent pathogène, ceci même avant l’accumulation de gènes de défense tel que PR-1. L’expression des deux GSTs est aussi corrélée avec la production d’éthylène et l’accumulation de SA dans la plante infectée; de plus, l’application externe de SA et d’éthylène induit fortement ces deux gènes. Grâce à l’étude de l’expression de AtGSTF2 et AtGSTF6 dans des plantes NahG et chez les mutants cpr1, npr1 et etr1, nous avons mis en évidence que l’expression de ces deux gènes dépend du SA, mais pas de la protéine NPR1. En outre, AtGSTF2 ne peut être exprimée dans le mutant etr1, indiquant que l’expression de ce gène est soumis à la présence simultanée de l’éthylène et du SA. Une étude fonctionnelle de la protéine AtGSTF2 chez la bactérie E.coli a permis de mettre en évidence une activité de glutathion peroxidase, capable de détoxifier des hydroperoxides d’acides gras in vitro. Cela suggère que AtGSTF2 pourrait jouer un rôle dans la gestion des dommages cellulaires occasionnés lors de la réaction hypersensible (HR) chez la plante. Beaucoup d’efforts ont été entrepris pour identifier des gènes induits lors de la SAR. Dans une étude sur le concombre, Marro (1997) a utilisé la technique d’amplification différentielle de l’ARNm, pour isoler de nouveaux gènes exprimés systémiquement après une infection locale. Marro a ainsi pu isoler un certain nombre de candidats groupés sous le terme générique “Cucumber Pathogen-Induced Genes” (CuPi). Nous avons cherché à compléter l’étude de l’expression de CuPi1 par une caractérisation fonctionnelle du produit de ce gène. Le gène, présent en copie unique, est exprimé dans le fruit, induit par des activateurs chimiques de la SAR et par plusieurs agents pathogènes, aussi bien dans les parties infectées que dans les feuilles systémiques des plantes de concombre. Le gène CuPi1 code pour une protéine de petite taille comprenant 87 acides aminés, qui présente des homologies avec ω-conotoxin, une toxine du venin d’un escargot marin (Conus geographus). Certains brefs motifs peptidiques et la plupart des résidus cystéine sont conservés entre les deux séquences. L’expression de CuPi1 s’est révélée toxique dans un système d’expression de type procaryotique, et la protéine a pu finalement être obtenu dans un système d’expression in vitro. Cependant, bien que plusieurs systèmes d’expression aient été utilisés pour produire CUPI1, il n’a pas été possible de l’isoler. D’autres approches, telle que l’analyse de plantes transgéniques exprimant CUPI1 pourraient se révéler prometteuses pour évaluer la fonction de la protéine in vivo.
    Summary
    In response to infection by pathogens, plants deploy various and complex defense mechanisms. Resistance can be expressed locally and systemically, depending on the nature of the inducing stimulus. For instance, after infection by a necrotizing pathogen, resistance develops throughout the plants, in tissues distant from the initial site of infection. This form of resistance, called systemic acquired resistance (SAR), is dependent of the local and systemic accumulation of salicylic acid (SA), which is involved in the concomitant activation of genes associated with defense against certain types of microorganisms. SA seems to play the role of an endogenous regulator. Besides SA, the plant hormones jasmonic acid (JA) and ethylene have been shown to be involved in the activation of separate sets of genes, the products of which mediate resistance against other types of pathogens. Much work is in progress to provide a comprehensive overview of the genes associated with defense and the function of their products. Besides restricting the growth of invading microbes, plants also evolved mechanisms to contain the tissue damage. However, such mechanisms have been poorly studied. We have first analyzed the expression of two members of the glutathione S-transferase (GST) multigene family, AtGSTF2 and AtGSTF6 in Arabidopsis thaliana inoculated with an avirulent strain of Pseudomonas syringae. Both GST genes, were expressed early and to a large extent after the inoculation of the pathogen, before the accumulation of the pathogenesis-related gene PR-1. The expression of the pathogen-induced GSTs correlated with the production of ethylene and the accumulation of SA upon pathogen attack, and both genes were strongly induced by application of exogenous SA or ethylene. Moreover expression studies in NahG plants, cpr1, npr1 and etr1 mutants revealed that AtGSTF2 and AtGSTF6 were SA-dependent but not under the control of NPR1. Interestingly, AtGSTF2 expression was also abolished in etr1, indicating that AtGSTF2 gene induction requires the combination of both SA- and ethylene-dependent signaling pathways. Furthermore, AtGSTF2 expressed in E.coli led to active glutathione peroxidase activity, capable to detoxify fatty acid hydroperoxides in vitro. Thus, AtGSTF2 might play a positive role in lowering the cellular damage caused during the process of hypersensitive response (HR). Large efforts were carried out to identify genes induced during SAR. In his study on cucumber, Marro (1997) has used mRNA differential display to isolate novel genes that are expressed systemically after a local infection. A number of candidates were found and grouped under the generic term of Cucumber Pathogen-Induced Genes (CuPi). We have further attempted to complete the expression study of CuPi1 by a functional characterisation of the protein. The single copy geneCuPi1 is constitutively expressed in fruit, induced by chemical activators of SAR and by various pathogens. CuPi1 encodes a small protein of 87 amino acids with homology to ω-conotoxin of a sea snail (Conus geographus) venom toxin. Small sequence motifs and many of the cysteine residues were conserved between the two sequences. The expression of CuPi1 was toxic for procaryotic expression systems, and the protein could only be expressed using an in vitro expression system. Although, different systems were used to express CUPI1, it was still not possible to purify it and to characterize its function. Other approaches such as the analysis of transgenic Arabidopsis thaliana expressing CUPI1 might be promising and could provide an answer to the function of the protein in vivo.