Faculté des sciences

Approche combinatoire de la production et de la purification de mutants de la streptavidine en vue de générer des métalloenzymes artificielles

Humbert, Nicolas ; Ward, Thomas (Dir.)

Thèse de doctorat : Université de Neuchâtel, 2005 ; 1817.

L'obtention de produits énantiomériquement purs revêt une importance vitale dans bon nombre de domaines, et notamment, dans l'industrie pharmaceutique. La catalyse asymétrique (= catalyse énantiosélective) permet d'obtenir ce genre de composés. Ce type de réaction peut être catalysé par un métal de transition coordonnée à un ligand chiral ou par une enzyme. Néanmoins, si chacun des... Plus

Ajouter à la liste personnelle
    Résumé
    L'obtention de produits énantiomériquement purs revêt une importance vitale dans bon nombre de domaines, et notamment, dans l'industrie pharmaceutique. La catalyse asymétrique (= catalyse énantiosélective) permet d'obtenir ce genre de composés. Ce type de réaction peut être catalysé par un métal de transition coordonnée à un ligand chiral ou par une enzyme. Néanmoins, si chacun des deux systèmes possède des avantages, ils présentent également quelques inconvénients. L'obtention de métalloenzymes artificielles par l'insertion de métaux catalytiques au sein de protéines permet de cumuler les caractéristiques propres aux deux systèmes. Le système biotine - (strept)avidine apparaît comme un outil de choix pour générer des métalloenzymes artificielles. L'avidine et la streptavidine (= (strept)avidine) présentent une forte affinité pour la biotine (Ka 1013 - 1015 M-1). Cette affinité ne baisse pas de manière significative lorsque la biotine est dérivatisée. Cette interaction a de nombreuses applications et représente le système le plus utilisé en ingénierie biologique après les anticorps. En absence de protéine, un complexe organométallique catalytique achiral biotinylé est capable de convertir un substrat prochiral en un produit racémique. En présence de (strept)avidine, la réaction devient énantiosélective grâce à l'environnement chiral apporté par la protéine. Dans ce travail, l'optimisation de la production de streptavidine par Escherichia coli (jusqu'à 210 mg/L de culture), sa purification et sa caractérisation ont été étudiées. Douze mutants ont été désignés plus ou moins rationnellement pour influer sur la position du métal lors des catalyses et ainsi modifier sa sélectivité. L'un d'eux (S112G) a apporté bon nombre d'améliorations lors des catalyses et une expérience de mutagenèse de saturation a été effectuée sur la position 112. Les problèmes d'activité ou de solubilité de certains mutants ont amené à modifier le protocole de purification de la protéine. Cette modification a permis d'augmenter le rendement de purification de ces mutants d'un facteur allant de 4 à 18. Par ailleurs, un criblage à haut débit de la fonctionnalité des mutants a été mis en place à l'aide d'une sonde biotinylée fluorescente, en partant d'extraits bactériens provenant de cellules cultivées en microplaques. Ce test permet d'envisager la sélection de variants fonctionnels au sein d'une large librairie de mutants obtenus par évolution dirigée de la streptavidine, mais aussi potentiellement de protéines chimériques avidine - streptavidine obtenues par DNA-shuffling.
    Summary
    The production of enantiopure products is critical in many fields, notably for the life science industry. Asymmetric catalysis (= enantioselective catalysis) is a good way to obtain this kind of compounds. It can be performed either by transition metals in a chiral environment or by enzymes. Both systems have some advantages and drawbacks. The generation of artificial metalloenzymes by the insertion of a catalytic metal into a protein allows cumulating the characteristics of both systems. The biotin - (strept)avidin system appears to be an ideal tool to generate some artificial metalloenzymes. The proteins avidin and streptavidin (= (strept)avidin) exhibit a very high affinity for the vitamin biotin (Ka 1013 - 1015 M-1). This affinity is not significantly affected by the derivatization of the biotin anchor. This system has numerous applications and is the second biological engineering system used in the world after antibody technology. In absence of protein, an achiral biotinylated catalytic organometallic complex is able to convert a prochiral substrate, but without any enantiomeric enrichment. In presence of (strept)avidin, the same reaction can become enantioselective due to the chiral environment provided by the protein. In the present work, the optimization of the production of streptavidin by Escherichia coli (up to 210 mg/L of culture), its purification and characterization were studied. Twelve mutants were rationally designed to influence the metal position during catalysis with the aim of increasing the selectivity. Mutant S112G proved versatile in terms of selectivity of the resulting metalloenzyme. Thus, position 112 was selected to perform a saturation mutagenesis. Certain variants exhibited a low solubility or a low activity. Some modifications of the purification protocol allowed to increase 4 to 18-fold the yield of the purified protein. In addition, a high-throughput screening method using a biotinylated fluorescent probe was developed, to test the functionality of bacterial extracts coming from cells cultivated in microplates. This test allows the selection of functional variants arising from a large mutant library obtained by directed evolution of streptavidin genes.