Faculté des sciences

A physiological and molecular approach to study organic acid exudation and development of cluster roots in Lupinus albus L

Langlade, Nicolas Bernard ; Martinoia, E (Dir.)

Thèse de doctorat : Université de Neuchâtel : 2002 ; 1614.

Les racines protéoïdes sont des structures en écouvillon, développées par des centaines d'espèces végétales (principalement de la famille des Protéacées, mais aussi de la légumineuse Lupinus albus, L.). Induites par des stress nutritifs, spécialement le phosphore, ces structures sont caractérisées par une forte capacité d'exsuder le citrate (jusqu'à 7 µmol .h-1 .g-1) et le malate... Plus

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    Résumé
    Les racines protéoïdes sont des structures en écouvillon, développées par des centaines d'espèces végétales (principalement de la famille des Protéacées, mais aussi de la légumineuse Lupinus albus, L.). Induites par des stress nutritifs, spécialement le phosphore, ces structures sont caractérisées par une forte capacité d'exsuder le citrate (jusqu'à 7 µmol .h-1 .g-1) et le malate dans la rhizosphère et donc d'augmenter la disponibilité du P, Fe et Mn. De plus, une grande variété de réponses à la carence en P (acidification, induction d'acide phosphatase, augmentation de la surface racinaire) qui mobilisent le phosphate inorganique (Pi) lié aux minéraux Ca, Al/Fe, aux complexes humiques et aux composés organiques se trouvent dans ces structures. Différents stades de développement des racines protéoïdes développées en déficience en P, ont été définies chez le lupin blanc et précisément décrits afin d'étudier leur développement et leur physiologie. Initiant ce projet, une approche par cDNA-AFLP (Amplified Fragments Length Polymorphism) a permis d'isoler des EST (Expressed Sequence Tags) correspondant à des gènes possiblement différemment exprimés dans les différents stades de développement. Parmi les 60 clones identifiés, la sucrose synthase (SuSy) et d'autres enzymes reliées à la glycolyse sont induites aux niveaux du transcrit et de l'activité dans les racines protéoïdes matures. Cela crée un fort puits, qui explique partiellement l'origine des squelettes carbonés exsudés sous forme de citrate. Les altérations métaboliques sous-jacentes de l'exsudation d'acides organiques, ont été étudiées plus précisément. Faisant partie des gènes différemment exprimés lors du criblage de l'AFLP, l'ATP citrate lyase (ACL) a été clonée pour la première fois chez les plantes. L'ACL est constituée de deux sous-unités, toutes deux nécessaires pour l'activité dans la levure comme système d'expression. Dans les racines protéoïdes juvéniles, l'ACL est fortement induite certainement pour produire l'Acetyl-CoA nécessaire à la synthèse lipidique. L'ACL transforme parallèlement le citrate en malate et en conséquence détermine la nature de l'acide organique préférentiellement exsudé dans les racines protéoïdes, ce qui constitue une nouvelle fonction pour cette enzyme. De plus, la discrimination précise des étapes du développement a été cruciale pour la compréhension des états énergétique, du pH cytosolique et du phosphate dans les différents types de racines protéoïdes, et des éléments régulant la bouffée exsudative au stade mature. Durant leur croissance les racines requièrent de grandes quantités de Pi (notamment pour les nucléotides). Les pools importants présents au stade juvénile sont réalloués après l'arrêt de la croissance. Par la suite, des réponses au manque de P, telles l'inhibition de la respiration, la diminution des contenus en ATP et Pi et l'augmentation des concentrations d'acides organiquessont donc observées. Combinées au surplus de production de carboxylates, nous assumons que cela entraine une forte acidification du cytosol au stade mature, ce qui induit l'acidification de la rhizosphère et active l'exsudation de citrate, principales caractéristiques des racines protéoïdes. Une connaissance détaillée du système racinaire entier nous a permis de réaliser avec succès une RDA (Representational Difference Analysis) pour comparer les tissus de façon plus stringente que l'AFLP. En utilisant cette technique, nous avons identifié un nouveau gène (LaTCP1) certainement impliqué dans le développement spécifique des racines protéoïdes et leur apparition au cours de l'évolution. L'analyse de son expression par RT-PCR et l'hybridation in situ a montré que la présence de LaTCP1 est restreinte aux méristèmes des racines protéoïdes émergentes. De plus, l'analyse de la séquence du messager et des contenus tissulaires en auxine a permis de relier LaTCP1 à l'auxine, qui a été montrée comme induisant la formation des racines protéoïdes. Cette seconde facette de ce travail constitue un premier résultat dans la compréhension moléculaire du développement structurel des racines protéoïdes et de leur apparition au cours de l'évolution comme adaptation aux sols très pauvres.
    Summary
    Cluster roots (or proteoid roots) are bottlebrush-like structures, developed by hundreds of plant species (mainly of Proteaceae family, but also the legume Lupinus albus L.) induced by nutrient stresses, especially P. These structures are characterized by a strong capacity to exude citrate (up to 7 µmol .h-1 .g-1) and malate in the rhizosphere and thus to increase the availability of P, Fe and Mn. Furthermore, a wide range of P deficiency responses (acidification, acidic phosphatase induction, root surface increase) which allow the mobilization of inorganic phosphate (Pi) bound to Ca, Al/Fe rocks, humic complexes and other organic compounds, are found in this structures. Different stages of cluster root development under P deficiency were defined in white lupin and precisely described in order to investigate their development and physiology. At the beginning of this work, a cDNA-AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) approach allowed us to isolate ESTs (Expressed Sequence Tags) corresponding to genes putatively differentially expressed in different developmental stages. Among the 60 clones identified, sucrose synthase (SuSy) and other glycolysis-related enzymes were shown to be induced at the mRNA and protein levels in mature cluster roots. This creates a high sink strength, which explains partially the origin of C skeletons exuded via citrate. Metabolic alterations underlying organic acids exudation, were investigated more extensively. Part of genes differentially expressed during the AFLP screen, the ATP citrate lyase (ACL) has been cloned for the first time in plants. ACL is constituted by to different subunits, both necessary for activity in yeast expression system. In juvenile cluster roots, ACL is strongly enhanced and is likely to produce the acetyl-CoA required for lipid synthesis. ACL also produces malate from citrate and consequently determines the nature of the organic acid preferentially exuded in cluster roots, which constitute a novel function for this enzyme. Furthermore, the accurate discrimination of developmental steps was crucial for the understanding of the energy, cytosolic pH and phosphate status in the different types of rootlets within a cluster and the regulatory elements leading to the exudative burst in mature stage. During their expansion rootlets need large amounts of Pi (notably for nucleotides). The important pools present at the juvenile stage are reallocated following to growth stop. Consequently, P deficiency responses are observed, such as respiration inhibition, decrease of ATP and Pi contents and increase of organic acid contents. Combined with the overflow of carboxylate production, we assume this produces a strong acidification of the cytosol in mature stage, which induces rhizosphere acidification and activates citrate exudation. A detailed knowledge of the complete root system allowed us to perform a successful RDA (Representational Difference Analysis), which compares tissues in more stringent conditions compared to AFLP. Using this technique, we identified a novel gene (LaTCP1) likely to be involved in the specific development of cluster roots and its evolutional apparition. Expression analysis by RT-PCR and in situ hybridization showed that the transcription of LaTCP1 is restricted to meristems of emerging cluster rootlets. In addition messenger and auxin contents analysis in different tissues allowed us to link La TCP1 to auxin, which has been shown to induce cluster roots formation. This second facet of the present work constitutes a first result in the molecular comprehension of cluster root structure development and evolutionary apparition as an adaptation to very poor soils.