Faculté des sciences

Interactions between members of the Bcl-2 family, other protein partners and new survival factors

Conus, Sébastien ; Borner, Christoph (Dir.) ; Simon, Hans-Uwe (Codir.)

Thèse de doctorat : Université de Fribourg, 2001 ; No 1351.

Des études génétiques et biochimiques du C. elegans ont montré que durant le développement, la mort cellulaire programmée requiert une activation de la caspase CED-3 par l’intermédiaire de CED-4. CED-9 agit lui comme protecteur de mort en interagissant directement avec CED-4 et en inhibant sa fonction. L’action de CED-9 peut être empêchée par liaison au facteur de mort Egl-1. Cette... Plus

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    Résumé
    Des études génétiques et biochimiques du C. elegans ont montré que durant le développement, la mort cellulaire programmée requiert une activation de la caspase CED-3 par l’intermédiaire de CED-4. CED-9 agit lui comme protecteur de mort en interagissant directement avec CED-4 et en inhibant sa fonction. L’action de CED-9 peut être empêchée par liaison au facteur de mort Egl-1. Cette machine apoptotique semble être conservée entre les vers et les mammifères, du moins à sa base. Plusieurs caspases, similaires à CED-3, ont été identifiées. Elles s’activent les unes les autres soit directement en une cascade proteolytique, soit par l’intermédiaire d’un adaptateur homologue à CED-4. Les membres de la famille de Bcl-2 sont abondants chez les mammifères et se composent de facteurs de survie (par exemple Bcl-2 et Bcl-xL) qui sont des homologues de CED-9 ainsi que des facteurs de mort (par exemple Bax et Bak) qui sont des homologues de Egl-1. Ces deux sous-familles se neutralisent les unes les autres par hétérodimérisation. Par contre, comme Bcl-2 et Bcl-xL n’agissent pas simplement en neutralisant Bax et Bak, ils doivent d’une façon ou d’une autre interagir et fonctionner à travers des homologues mammifères de CED-4 si le processus de mort est conservé durant l’évolution. Le premier homologue de CED-4 à avoir été identifié, est Apaf-1. Cependant et contrairement aux signaux de mort dans le C. elegans, Apaf-1 dépend pour sa fonction d’activation des caspases (en l’occurrence caspase-9), d’une protéine mitochondriale, le cytochrome c, qui est libérée dans le cytosol par induction de l’apoptose. Bien que précédemment, il a été publié que Bcl-2 et Bcl-xL pouvaient interagir avec Apaf-1, beaucoup de comptes rendus ont montré que ces protéines agissent en fait en amont d’Apaf-1 afin de bloquer la libération du cytochrome c. Ils interagissent donc probablement avec un homologue de CED-4 qui endommage directement ou indirectement les mitochondries. En plus de ce modèle d’interaction de CED-4, la similitude des structures cristallines de Bcl-xL et de Bax avec la toxine bactérienne formant des pores, suggérait que les membres de la famille de Bcl-2 pouvaient agir comme des canaux ioniques ou protéiniques ou alors comme des pores. Un tel mode d’action serait facile à imaginer pour Bax et Bak étant donné que leur fonction sur les mitochondries est de libérer du cytochrome c, mais il est plus difficile d’envisager une fonction de formation de pores pour l’activité anti-apoptotique de Bcl-2 et de Bcl-xL. Cette thèse avait comme objectif d’obtenir plus d’informations dans l’interaction entre Bcl-2 et Bax, de savoir si ces molécules peuvent homodimériser et potentiellement former des canaux, de tester si Apaf-1 est vraiment une protéine cible des membres de la famille de Bcl-2, de comprendre le mécanisme par lequel Bax libère le cytochrome c et finalement de cloner des nouveaux facteurs de survie. Premièrement, nous montrons que Bcl-2 ne forme pas volontiers des homodimères autant in vitro qu’à l’intérieur de la cellule, cela même sous des conditions où Bcl-2 la protège de l’apoptose, alors que Bax effectivement di- ou multimérise. Ceci indique que Bcl-2 n’est probablement pas capable de former un canal de lui-même. Deuxièmement, nous n’avons pu trouver aucune interaction entre Apaf-1 et Bcl-2, Bcl-xL ou Bax, in vitro et dans des cellules intactes. Par conséquent, nous sommes défavorables à la notion que Apaf-1 forme un apoptosome mammifère avec Bcl-2 ou Bcl-xL, même lorsqu’ils agissent comme des facteurs de survie. Néanmoins, il est encore possible que l’interaction entre Apaf-1 et les membres de la famille de Bcl-2 soit indirecte ou via un autre homologue de CED-4. Troisièmement, nous démontrons qu’il n’y a aucune autre protéine qui s’associe stablement et en quantités détectables avec Bcl-2, Bax ou leur hétérodimère dans des cellules normales et apoptotiquement stressées. De plus, nous révélons que le degré de protection contre l’apoptose ne correspond pas au nombre d’hétérodimères Bcl-2/Bax, mais à la quantité de Bcl-2 qui est libre de Bax. Cela indique que Bcl-2 ne requiert ni Bax, ni d’interaction majeure et stable avec d’autres protéines cellulaires pour exercer sa fonction de survie. Quatrièmement, nous sommes capables de prouver que Bcl-2 ne réussit pas à prévenir la libération du cytochorme c provoquée par Bax dans des cellules surexprimant stablement Bcl-2 et Bax. De plus, ces cellules ne montrent aucun signe d’activation des caspases et survivent avec des quantités importantes de cytochorme c dans le cytosol, dénotant ainsi que Bcl-2 peut interférer avec la mort induite par Bax en aval et indépendemment de la libération du cytochrome c. Cinquièmement, nous découvrons une connexion entre le réticulum endoplasmique et les mitochondries contrôlée par Bcl-2. De manière surprenante, la libération du cytochrome c induite par la drogue brefeldine A (BFA) ou tunicamycine n’est pas seulement bloquée par le Bcl-2 wild-type, mais aussi par une variante de Bcl-2 exclusivement présente sur le réticulum endoplasmique. Finalement, nous isolons de possibles nouveaux facteurs de survie par une analyse fonctionnelle. Elle consiste à sauver des cellules qui ont été précédemment transfectées avec une librairie de phagemides de cDNA préparée à partir d’une source ARN de lymphomes Burkitt humains et exposées à des doses toxiques de staurosporine.
    Summary
    Genetic and biochemical studies in C. elegans have shown that developmental programmed cell death requires a CED-4 mediated activation of the caspase CED-3. CED-9 acts as a death protector by directly interacting with and inhibiting the function of CED-4. CED-9 can be prevented from acting by binding to the death factor Egl-1. This apoptotic machinery seems to be conserved between worms and mammals, at least at its base. Several CED-3-like caspases have been identified which either activate each other in a proteolytic cascade or depend on an adapter-like CED-4 homologue for their activation. Members of the Bcl-2 family are plentiful in mammals and consist of both survival factors (Bcl-2, Bcl-xL), which are CED-9 homologues, and death factors (Bax, Bak), which are Egl-1 homologues, neutralizing each other through heterodimerization. However, as Bcl-2 and Bcl-xL do not simply act via Bax/Bak neutralization, they must somehow interact and work through mammalian CED-4 homologues if the death pathway is evolutionary conserved. The first CED-4 homologue identified was Apaf-1. In contrast to death signals in C. elegans, Apaf-1 however depends for its caspase activation function (caspase-9) on a mitochondrial protein, cytochrome c, that is released into the cytosol upon apoptosis stimulation. Although it was previously published that Bcl-2 and Bcl-xL could interact with Apaf-1, many reports have shown that these proteins act upstream of Apaf-1 to block the release of cytochrome c. Thus, they probably interact with a CED-4 homologue that damages mitochondria directly or indirectly. In addition to this CED-4 interaction model, the homology of the crystal structure of Bcl-xL and Bax with pore-forming bacterial toxin suggested that Bcl-2 family members could act as ion or protein conducting channels or pores. While one could easily imagine such a mode of action for Bax and Bak, because their function on mitochondria is to release cytochrome c, it is more difficult to envisage a pore forming function for the anti-apoptotic activity of Bcl-2 and Bcl-xL. The goal of this thesis was to get more insights into the interaction between Bcl-2 and Bax and whether these molecules could homodimerize and potentially form channels, to test whether Apaf-1 is indeed a protein target of Bcl-2 family members, to understand the mechanism by which Bax releases cytochrome c and to clone new survival factors. Firstly, we show that while Bax effectively di- or multimerizes, naturally occurring Bcl-2 does not readily form homodimers both in vitro and within cells even under conditions when Bcl-2 protects them from apoptosis. This indicates that Bcl-2 is probably not able to form a channel by itself. Secondly, we can not find any interaction between Apaf- 1 and Bcl-2, Bcl-xL or Bax both in vitro and in intact cells. We therefore disfavor the notion that Apaf-1 forms a mammalian apoptosome with Bcl-2 or Bcl-xL even when they act as survival factors. Nevertheless, it is still possible that the interaction between Apaf-1 and the Bcl-2 family members is indirect or via another CED-4 homologue. Thirdly, we demonstrate that there is no other protein that associates stably in detectable amounts with Bcl-2, Bax or the heterodimer in normal and apoptotically stressed cells. Moreover, we reveal that the degree of protection against apoptosis does not correlate with the number of Bcl-2-Bax heterodimers but with the amount of Bcl-2 that is free of Bax indicating that Bcl-2 requires neither Bax nor major, stable interactions with other cellular proteins to exert its survival function. Fourthly, we were able to prove that Bcl-2 fails to prevent Bax-induced cytochrome c release in cells stably overexpressing both Bcl-2 and Bax. In addition, these cells show no signs of caspase activation and survive with significant amount of cytochrome c in the cytosol denoting that Bcl-2 can interfere with Bax killing downstream of and independently of cytochrome c release. Fifthly, we discover a crosstalk between the endoplasmic reticulum (ER) and mitochondria controlled by Bcl-2. Surprisingly, cytochrome c release induced by the drug brefeldin A (BFA) or tunicamycin is not only blocked by wild-type Bcl-2, but also by a Bcl-2 variant that is exclusively targeted to the ER. Finally, we isolate new putative survival factors from a functional assay where cells are rescued after transfecting a cDNA phagemid library from a human Burkitt lymphoma RNA source and exposing them to toxic doses of staurosporine.