Faculté des sciences

GPI anchor attachment in yeast : analysis of Gpi8p, the putative catalytic subunit of the GPI: protein transamidase

Meyer, Urs ; Conzelmann, Andreas (Dir.) ; Puoti, Alessandro (Codir.)

Thèse de doctorat : Université de Fribourg, 2001 ; Nr. 1323.

L’attachement des protéines à la surface cellulaire par l’intermédiaire d’ancres glycosyl phosphatidylinositol (GPI) est ubiquitaire chez les eucaryotes. L’ancrage GPI est indispensable à la viabilité des levures. Chez les mammifères, bien que dispensable pour la survie d’une cellule isolée, il joue un rôle primordial lors des interactions cellule- cellule ou... Plus

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    Résumé
    L’attachement des protéines à la surface cellulaire par l’intermédiaire d’ancres glycosyl phosphatidylinositol (GPI) est ubiquitaire chez les eucaryotes. L’ancrage GPI est indispensable à la viabilité des levures. Chez les mammifères, bien que dispensable pour la survie d’une cellule isolée, il joue un rôle primordial lors des interactions cellule- cellule ou cellule-environnement, ainsi, par exemple lors de l’embryogenèse. Les protéines ancrées GPI remplissent un grand nombre de fonctions. A la surface de certains parasites elles ont un rôle immunoprotecteur, elles entrent dans la composition de la paroie chez les levures, sont des récepteurs chez les mammifères, interviennent lors de l’adhésion cellulaire, remplissent des fonctions enzymatiques ou comme antigènes de différenciation. Bien que différents rôles aient été proposés pour les ancres OPI, dont:l’adressage des protéines, la signalisation transmembranaire, et la potocytose, leur principale fonction reste l’attachement des protéines à la surface externe de la membrane plasmique d’une manière aussi efficace et stable que pour les domaines transmembranaires polypeptidiques. Cependant les ancres GPI différent des ancres polypeptidiques à plusieurs titres: la mobilité latérale, la sensibilité aux lipases extracellulaires, l’indépendance vis-à-vis du cytoplasme et du cytosquelette et le mode de transport intracellulaire différent. Le précurseur d’un protéine GPI est synthétisé avec 2 séquences signal; l’une, en N terminal, permet l’entrée de la protéine dans la voie de sécrétion; l’autre, en C terminal, constitue la séquence signal GPI (GPI-SS) nécessaire à l’attachement de l’ancre GPI. Le transfert de l’ancre GPI a lieu dans le lumen du réticulum endoplasmique et consiste en l’attachement d’un glycolipide GPI déjà prêt à une protéine GPI immature dont la séquence signal GPI est coupée à ce moment. Il a été proposé que ce processus soit catalysé par un complexe transamidase GPI:protéine. Deux sous-unités pouvant appartenir à ce complexe ont été identifiés: Gaalp et Gpi8p. Le rôle exact de Gaalp est inconnu, cependant que Gpi8p, du fait de son homologie avec des protéases à cystéine végétales, pourrait être la sous-unité catalytique d’un éventuel complexe transamidase. L’objectif principal de ce travail est de mieux caractériser la protéine Gpi8 chez la levure, et de mieux définir son rôle dans l’attachement de l’ancre GPI. Par mutagenèse dirigée, le site actif de Gpi8p, composé d’une diade (C199 et H157) a été identifié; celui-ci est similaire au site actif des caspases. Cela renforce l’hypothèse selon laquelle Gpi8p serait directement impliquée dans la coupure de la séquence signal GPI en C terminal. Cependant aucun mutant gpi8 n’a pu être isolé par un crible de mutants gpi8 obtenus par mutagenèse “au hasard” par PCR, et ayant une activité protéolytique in vitro. De plus, une hypothèse récente selon laquelle la Gpi8p humaine, seule, serait responsable de la reconnaissance de la phosphatase alcaline placentaire humaine peut être considérée comme fausse. Cette étude ainsi que le fait que la surexpression de Gpi8p ne peut restaurer une maturation normale chez des mutants Gasip ayant une séquence signal modifiée, suggèrent que d’autres protéines sont impliquées dans la reconnaissance spécifique de GPI-SS. Un crible destiné à rechercher des gènes capables de restaurer la croissance de cellules sauvages surexprimant l’allèle dominant négatif de Gpi8p, C199A, a été fait. Les gènes de fonction inconnue ainsi identifiés doivent être plus amplement analysés. De plus, deux allèles de GPI8 dont la croissance s’arrête complètement à la température restrictive ont été identifiés et sont des outils prometteurs pour un crible de "létalité synthétique". Finalement, une base de données relationnelle a été établie et un certain nombre de gènes pouvant être impliqués dans le processus de remodelling de la partie lipidique de l’ancre GPI ont été retenus après une analyse des séquences de protéines à l’aide de logiciels disponibles sur internet.
    Zusammenfassung
    Die Verankerung von Ze11oberflächenproteinen in der Zellmembran mit Hilfe von Glykosylphosphatidylinositol(GPI)-Ankern ist ubiquitär bei Eukaryonten. Die GPI Verankerung ist essentiell für das Überleben von Hefezellen. In Säugetieren hingegen ist sie nicht erforderlich für das Überleben der einzelnen Zelle, spielt aber eine wichtige Rolle bei Interaktionen von Zellen untereinander und mit ihrer Umgebung wie sie beispielsweise bei der Embryogenese wichtig sind. GPI-Proteine sind für eine Vielzahl von verschiedenen Funktionen verantwortlich, wie z.B. ais immunprotektive Oberflächenmantelproteine, Zellwandproteine in der Hefe, Säugetier-Rezeptoren, Zelladhäsionsmolekülen, Differenzierungsantigene, und als Enzyme. Obwohl den GPI Ankern verschiedene spezielle Funktionen zugeschrieben wurden, wie z.B. beim intrazellulären Sorting, der transmembran Signalübertragung, und der Potozytose, so besteht doch ihre fundamentalste Funktion im Verankern von Proteinen in der äusseren Lipidschicht der Plasmamembran, und zwar auf eine stabile und effiziente Weise, vergleichbar mit einer transmembran Po1ypeptiddom Trotzdem unterscheiden sich GPI-Anker von transmembranären Ankern in vielerlei Hinsicht, nämlich der lateralen Mobilität, der Empfindlichkeit gegenüber extrazellulären Lipasen, der physikalischen Abschirmung vom Zytosol und Zytoskelett, und dem interzellulären Proteintransfer. Ein Vorläufer eines GPI-Proteins wird synthetisiert mit einer N-terminalen Signalsequenz, die notwendig für den Eintritt in den sekretorischen Weg, und einer C-terminalen GPI-Signalsequenz (GPI-SS), die verantwortlich für die GPI Verankerung ist. Der Prozess der GPI-Verankerung läuft im Lumen des endoplasmatischen Retikulums (ER) ab und besteht in der Obertragung eines vorgebildeten GPI-Glykolipids auf ein unreifes GPI protein, was zu dessen Verlust der GPI-SS führt. Diese Reaktion wird vermutlich durch einen GPI:Protein-Transamidase Komplex katalysiert. Zwei mögliche Untereinheiten dieses Komplexes wurden identifiziert, Gaalp und Gpi8p. Welche Rolle Gaalp spielt, ist unklar, während Gpi8p vermutlich die katalytische Untereinheit des Transamidase-Komplexes bildet, dies aufgrund von Homologien zu pflanzlichen Cysteinproteasen. Die vorliegende Studie hat ais Hauptziel die weitere Beschreibung des Hefeproteins Gpi8 and seiner Rolle im Prozess der GPI-Verankerung. Durch gerichtete Mutagenese wurde das aktive Zentrum von Gpi8p als Diade (aus C199 und Hi57) identifiziert, welches ähnlich ist zu demjenigen in Caspasen. Das unterstützt die Hypothese, dass Gpi8p direkt beim Abschneiden der GPI-SS beteiligt sein könnte. Wie dem auch sei, mit ungerichteter PCR Mutagenese konnte keine Gpi8p-Mutante gefunden werden, die in vivo proteolytisch aktiv war. Des weiteren konnte eine kürzlich gemacht Hypothese, weiche besagte, dass Gpi8p alleine für die Erkennung der GPI-SS der menschlichen alkalinen Phosphatase der Piazenta verantwortlich sei, ais falsch aufgezeigt werden. Diese Studie zusammen mit einem Experiment, welches zeigte, dass die Überexpression von Gpi8p den teilweisen Reifungsdefekt von Gaslp-Mutanten mit einer veränderten GPI-SS nicht supprimieren konnte, zeigt auf, dass neben Gpi8p wahrscheinlich auch andere Proteine bei der spezifischen Erkennung der GPI-SS beteiligt sind. Mit einem Multicopy-Suppressor Screen für Gene, welche das Wachstum von Wildtyp-Zellen, die die dominant-negative Gpi8p-Mutante C 199A überexprimierten, wiederherstellten, wurden unbekannte Gene identifiziert, die noch genauer analysiert werden müssen. Des weiteren wurden zwei gpi8 Allele mit einem starken temperaturabhängigen Wachstumsdefekt als vielversprechende Werkzeuge für einen Synthetic-Lethality-Screen identifiziert. Eine relationale Datenbank für Hefe-GPI-Proteine wurde aufgebaut. Des weiteren, wurden verschiedene ORFs als Kandidaten für Enzyme, welche Lipide auf den GPI-Ankern austauschen, durch die Suche nach Homologien mit Hilfe von web-basierten Sequenzanalyseprogrammen gefunden. 1k Mitwirken beim sogenannten Lipid-Remodeling wird zur Zeit getestet.
    Summary
    Membrane anchoring of ceil surface proteins by means of glycosyl phosphatidyl-inositol (GPI) anchors is ubiquitous among eucaryotes. GPI anchoring is essential for yeast viability. In mammals, GPI anchoring is not required at the cellular level, but plays an important role in ceil to ceil and ceil to environment interactions which for example are critical during embryogenesis. GPI proteins can have a wide variety of different functions, e.g. as immunoprotective parasitic surface coat proteins, yeast ceil wall proteins, mammalian receptors, ceil adhesion molecules, differentiation antigens and enzymes. Although several functions have been proposed for the GPI anchor itself, e.g. intracellular sorting, transmembrane signalling, or potocytosis, its most fundamental function consists in the attachment of proteins to the outer leaflet of the plasma membrane in an efficient and stable manner, comparable with a transmembrane polypeptide domain. However, GPI protein anchors may differ from transmembrane anchors in several respects such as lateral mobility, sensitivity to extracellular lipases, physical isolation from the cytoplasm and the cytoskeleton, and intercellular protein transfer. A GPI precursor protein is synthesized with a cleavable N terminal signal sequence required for the entry into the secretory pathway and a C terminal GPI signal sequence (GPI-SS) required for GPI anchor attachment. The process of GPI anchor attachment occurs in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) and consists in the transfer of a preformed GPI glycolipid onto an immature GPI protein which results in removal of the GPI-SS. The process was suggested to be catalyzed by a GPI:protein transamidase complex. Two putative subunits of this complex were identified, Gaalp and Gpi8p. The exact role of Gaalp is unknown, whereas Gpi8p, because of its homology to plant cysteine proteases, is believed to be the catalytic subunit of the transamidase complex. This study had as major objective the further characterization of the yeast Gpi8p itself and of its role in the process of GPI anchor attachment. By site-directed mutagenesis, the active site of Gpi8p consisting of a diad (C 199 and H 157) was identified and found to be similar to that of caspases. This supports the hypothesis that Gpi8p protein might be directly involved in removal of the C terminal GPI signal sequence. However, no Gpi8p mutant could be isolated in a screen with random PCR mutagenized gpi8 alleles which shows proteolytic activity in vivo. Furthermore, a recently made hypothesis which claimed that human Gpi8p alone was responsible for the recognition of the GPI-SS of human placental alkaline phosphatase could be shown to be incorrect. This finding together with an experiment which showed that overexpression of Gpi8p could not suppress the partial maturation defect of Gas1p mutants having an altered GPI-SS, suggests that other proteins are involved in the specific recognition of the GPI-SS. A multicopy suppressor screen for genes which restored growth in wt cells overexpressing the dominant-negative active site mutant of Gpi8p, Cl99A, identified unknown genes which should be further analyzed. Moreover, two gpi8 alleles were identified which show a strong temperature sensitive defect for growth as promising tools for a synthetic lethality screen. A relational database for yeast GPI proteins was established. Furthermore, several ORFs were identified as candidates for enzymes which exchange the lipid moieties of GPI anchors by homology searches with www-based sequence analysis software. Their participation in the so-called lipid remodeling is currently tested.