Faculté des sciences

Arabidopsis-Phytophthora, un pathosystème modèle pour la caractérisation d'une interaction entre une plante et un pathogène oomycète

Roetschi, Alexandra ; Mauch, Felix (Dir.) ; Gisi, Ulrich (Codir.) ; Métraux, Jean-Pierre (Codir.)

Thèse de doctorat : Université de Fribourg, 2001 ; no 1345.

Les Oomycètes sont de redoutables pathogènes pour les végétaux, particulièrement pour les plantes de culture et les pertes annuelles occasionnées par ces organismes sont considérables. Leur biologie est très différente de celle des champignons, même s’ils partagent avec ces derniers un mode de croissance mycélaire. Ainsi, il n’est pas aisé de les combattre et il n’existe que peu... Plus

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    Résumé
    Les Oomycètes sont de redoutables pathogènes pour les végétaux, particulièrement pour les plantes de culture et les pertes annuelles occasionnées par ces organismes sont considérables. Leur biologie est très différente de celle des champignons, même s’ils partagent avec ces derniers un mode de croissance mycélaire. Ainsi, il n’est pas aisé de les combattre et il n’existe que peu de fongicides capables de stopper une épidémie de manière durable. Leur biologie particulière, encore peu connue, rend ces organismes très intéressants à étudier de même que les mécanismes régissant les interactions avec leurs hôtes respectifs. Un nouveau pathosystème a été élaboré en utilisant Phytophthora porri, un Oomycète infectant, entre autres, les choux (Brassica sp.) comme pathogène et Arabidopsis thaliana, une petite Brassicacée, comme hôte. Ce choix a été motivé par le caractère de plante modèle possédé par A. thaliana ainsi que par la qualité de biotrophe facultatif de P. porri, avantage que l’on ne retrouve pas chez tous les Oomycètes. Ainsi, pour la première fois lors d’une interaction entre un Oomycète et une plante, il est possible d’étudier non seulement l’interaction mais aussi les deux partenaires aux niveaux moléculaires et génétiques. Cette thèse a fait suite à mon travail de diplôme, dans lequel il s’est agi, à partir d’une quinzaine d’écotypes d’A. thaliana et de sept isolats de P. porri, d’une part de déterminer si cette plante pouvait servir d’hôte pour ce pathogène et d’autre part, d’établir une méthode d’inoculation fiable et reproductible. Ainsi, lorsque A. thaliana est infectée par P. porri, deux types d’interactions ont pu être observées lors de la caractérisation cytologique. On trouve une interaction incompatible, dans laquelle P. porri est très rapidement stoppé dans sa progression par les différentes barrières mises en place par A. thaliana, dont par exemple la réaction hypersensible qui représente la mort cellulaire d’une ou de plusieurs cellules végétales à l’endroit où le pathogène a tenté de s’introduire. On observe aussi une interaction compatible, dans laquelle la colonisation du tissu par le pathogène a lieu sans qu’il y ait de réaction visible de la part de la plante. P. porri est ainsi capable d’effectuer son cycle de vie en élaborant ses structures de reproduction végétative et sexuée dans le tissu végétal de l’hôte compatible, ce qui confirme que cet Oomycète est un véritable pathogène pour A. thaliana. Dans cette thèse, l’implication de différentes voies de biosynthèse présentes chez A. thaliana et conduisant à un état résistant dans d’autres pathosystèmes a été étudié dans le cadre de l’interaction entre cette Brassicacée et P. porri. Il a pu être établi par une analyse biochimique et moléculaire, que les principales voies de défense, à savoir celles de l’acide salicylique, de l’acide jasmonique, de l’éthylène ainsi que celle conduisant à la synthèse des phytoalexines sont mises à contribution lors du processus d’infection mais qu’elles ne sont toutefois pas les principales responsables de l’état résistant. Par ailleurs, de l’étude de mutants de ces quatre différentes voies de biosynthèse, un mutant, originellement isolé lors d’un criblage pour la déficience dans l’accumulation de phytoalexines après inoculation avec une bactérie virulente et nommé de ce fait pad 2-1, a été mis en évidence car ce dernier a présenté un phénotype d’extrême susceptibilité envers P. porri alors que les autres mutants (npr 1-1, jar 1-1, etr 1-1, ein 2.1, pad 3-1) et le transformant nahG, de même que l’écotype sauvage sont eux restés résistants suite à leur inoculation avec cet Oomycète. Des expériences d’induction d’une réaction systémique acquise, effectuées à l’aide d’un inducteur biotique et abiotique, ont donné une indication supplémentaire que la voie de l’acide salicylique, qu’elle soit enclenchée ou non, n’a pas le pouvoir d’inverser un phénotype susceptible vers un phénotype résistant. Ceci a aussi permis de confirmer les résultats des analyses biochimiques et moléculaires, desquelles découlent que pad2 est aussi empêché dans la voie de l’acide salicylique. Ainsi, la résistance envers P. porri semble être régie par un mécanisme différent de ce que l’on connaissait jusqu’à présent pour d’autres interactions impliquant une plante et un Oomycètre et nécessite un gène PAD2 fonctionnel. Par ailleurs, une analyse génétique a permis d’établir que la résistance envers P. porri est régie par au moins un gène de résistance et ceci s’est vu confirmé par le phénotype susceptible de deux mutants (ndr 1-1 et eds 1.1) empêchés dans les voies de biosynthèse situées en aval de la reconnaissance gène pour gène. Un autre aspect étudié a été le rôle d’une petite protéine lors du processus d’infection. Cette dernière est abondamment sécrétée par P. porri lorsqu’il est placé en culture liquide. L’infiltration d’un filtrat de culture dans des feuilles de Nicotiana benthamiana, une Solanacée très sensible envers divers éliciteurs, a causé des nécroses sur la surface infiltrée alors que chez A. thaliana une réaction différentielle a pu être mise en évidence, ce qui indique un processus de reconnaissance selon l’écotype testé. La protéine responsable de ces réactions a été identifiée comme étant une élicitine et a été nommée Porrine I. Le gène codant pour cette dernière a été cloné est s’est révélé faire partie d’une famille multigénique à l’instar des autres élicitines isolées chez la plupart des Phytophthora. L'ARN de Porrine I a pu être mis en évidence lors de l’interaction compatible toutefois il n’a pas été possible, dans le cadre de cette thèse, de clarifier la fonction biologique de cette élicitine.
    Summary
    Oomycetes are pathogens responsible for many plant diseases over the world and the economical impact of their damage is quite important. Although these organisms show a mycelar growth, their biology is quite different from that of fungi. This makes them not easy to fight against and up to now no fungicide is able to stop an epidemy due to Oomycetes in a durable way. The particular biology of these organisms, which is still not well known, makes them very interesting to study together with the study of the mechanisms of the interactions with their hosts. A novel pathosystem using Phytophthora porri as pathogen, an Oomycete infecting, among other hosts, cabbage (Brassica sp.) and Arabidopsis thaliana, a little weed from the family of the Brassicacea, was established. The choice of both protagonists was justified by the feature of plant model owned by A. thaliana and because P. porri is a facultative biotroph, an advantage not shared by every Oomycete. With this pathosystem, it will be possible, for the first time, to study not only the plant-Oomycete interaction but also both organisms separately because they are amenable to molecular and genetical studies. This thesis is the next step after my diploma work, which aim was to set up the novel pathosystem. For this, 15 accessions of A. thaliana and 7 isolates of P. porri were screened in order to find accessions that could be hosts for P. porri and to establish a reproducible and reliable inoculation method. The cytological characterisation of the interaction enabled to distinguish between two distinct interactions. First, an incompatible interaction in which the growth of P. porri is rapidly stopped by the various hindrances built up by A. thaliana, among them the hypersensitive reaction which represents the death of one or several cells around the location where the pathogen attempted to penetrate. Secondly, a compatible interaction, in which the colonisation of the tissue by the pathogen takes places without any visible reaction of the plant. P. porri is able to complete its whole life cycle by producing its vegetative and sexual structures in the plant tissue of the compatible host, which confirms that this Oomycete is a true pathogen of A. thaliana. In this thesis, the implication of different biosynthetic pathways leading to resistance in A. thaliana, as observed in other plant-pathogen interactions, was investigated during the interaction between this plant and P. porri. Biochemical and molecular analysis established that the main defense pathways of A. thaliana, namely the salicylic acid-, the jasmonic acid- and the ethylene pathways as well as the one leading to the biosynthesis of the phytoalexins are induced during the interaction but are not the principal components of the resistance phenotype. The study of mutants impaired in these four different biosynthetic pathways resulted in the discovery that a mutant originally found in a screen for deficiency in phytoalexin accumulation after inoculation with a virulent bacteria and named pad 2-1, showed a hypersusceptible phenotype towards P. porri when all the other mutants (npr 1-1, jar 1-1, etr 1-1, ein 2.1 and pad 3-1) and the transformant nahG showed, like the wild type, resistance. The induction of systemic acquired resistance, with a biotic and an abiotic inducer, helped to show that the salicylic acid pathway is not involved because there is no switch from the susceptible phenotype towards a resistant phenotype when this pathway is turned on. The biochemical and molecular analysis also showed that pad2 is impaired in the salicylic acid pathway. So, the resistance towards P. porri seems to be under the control of a different mechanism than the one known so far for plant-Oomycete interactions and requires a functional PAD2 gene. A genetical analysis showed that the resistance is under the control of at least one resistance gene and this was confirmed by the susceptible phenotype of two mutants (ndr 1-1 and eds 1.2) which are impaired in the signalling pathways lying downstream of the gene-for-gene recognition events. Another aspect investigated was the role of a small protein during the infection process. This protein is abundantly secreted by P. porri in liquid culture and the infiltration of a culture filtrate in leaves of Nicotiana benthamiana, a Soleanaceous species very sensitive towards different elicitors, caused necrosis in the infiltrated area. When A. thaliana leaves were infiltrated with the same culture filtrate, a differential reaction was observed which indicates a recognition mechanism depending on the accession tested. The protein responsible for these reactions was identified as an elicitin and was named Porrine I. The gene coding for this protein was cloned and shown to belong to a multigene family as other elicitins produced by various Phytophthora species. The RNA of Porrine I could be detected during the compatible interaction but it was not possible, during this thesis, to clarify the biological function of this elicitin.