Faculté des sciences de base SB, Section de physique, Institut de physique de la matière complexe IPMC

Calcium dynamics and intercellular communication in arterial smooth muscle cells

Lamboley, Mathieu ; Meister, Jean-Jacques (Dir.)

Thèse sciences Ecole polytechnique fédérale de Lausanne EPFL : 2004 ; no 3161.

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    Summary
    This thesis is a contribution to the field of cellular communication in arteries during vasomotion, i.e. rhythmic and spontaneous diameter oscillations of arteries. Investigating how individual smooth muscle cells (SMCs) and endothelial cells (ECs) calcium variations interact to induce an arterial response is a key to understanding the physical mechanisms leading to contraction and vasomotion. This study is composed of two main experimental parts using rat mesenteric arteries: a study on recruitment and synchronization of SMCs and an analysis on SMCs-ECs communication in arterial strips. The introduction is an overview of the mechanism leading to arterial vasomotion. We focused on the calcium signaling between SMCs, between ECs and between SMCs and ECs. In the chapter "Material and methods", we present the different experimental techniques we developed or improved in order to study calcium signaling in SMCs and/or ECs. For this purpose, we used arterial strips or cannulated arteries using a confocal microscope or a conventional microscope. Calcium concentration were measured using fluorescent dyes. These methods allow the correlation of calcium oscillations of individual SMCs, of individual ECs or both, together with mean calcium variations and arterial contraction. In chapter 3, we investigated the behavior of individual SMCs in order to determine if all cells presented the same variations of calcium concentration as the mean calcium variations or if vasomotion results of an unequal contribution of each SMC. Arterial strips were stimulated by increasing concentration of vasoconstrictors phenylephrine (PE) or potassium chloride (KCl). We revealed that the number of SMCs presenting calcium variations and their synchronization depend on vasoconstrictor concentration. At low vasoconstrictor concentration, few cells present asynchronous calcium variations and no local contraction is detected. Recruitment of cells is complete and synchronous at medium concentration, leading to strip contraction after KCl stimulation and to vasomotion after PE stimulation. High concentration of PE leads to synchronous oscillations and a fully contracted arterial strip, whereas high concentration of KCl leads to a sustained non-oscillating increase of calcium and to fully contracted vessels. We conclude that the number of simultaneously recruited cells is an important factor in controlling artery contraction and vasomotion. In chapter 4, we investigated the three main possible ways to synchronize the recruitment of SMCs when stimulating with PE and KCl. We tested the importance of calcium voltage-gated channels (VOCs) and thus the electrical communication, by using different inhibitors of the VOCs. We also tested the importance of stretch-activated channels (SACs) by inhibiting contraction of individual SMCs. Finally, we verified the importance of gap junctions and thus of chemical and/or electrical coupling. We applied a gap junction inhibitor and we also performed microinjection of fluorescent dyes in single SMCs. Our results provide evidence that under PE the synchronization of the SMCs recruitment occurred electrically through gap junctions. Under KCl, every SMC was simultaneously depolarized and calcium entered the cell simultaneously through VOCs. This leads to a global [Ca2+]i increase. When we studied the recruitment and synchronization of the SMCs under PE, we sometimes observed intercellular calcium waves propagating between SMCs in a direction corresponding to the arterial axis. In chapter 5, we used a tracking process to quantify these intercellular waves. We found that intercellular calcium waves propagating along the strip were linked to the local contraction variations. The velocity of both waves are similar (~60 µm/s). This method of tracking is particularly powerful for the study of cellular communication in arteries. It has the advantage of allowing the correlation of calcium with contraction dynamics. The role of the endothelium for vasomotion is matter of debate. SMCs and ECs are electrically and chemically coupled allowing exchange of intercellular signaling. In chapter 6, we investigated heterocellular communication at the cellular level in order to understand how SMCs can influence ECs calcium dynamics. SMCs of the arterial strip were stimulated by KCl and by PE. We verified that PE and KCl did not directly act on the calcium concentration of ECs. Depending on vasoconstrictor concentration, calcium concentration increased in some ECs 5 to 11 s after that a calcium concentration increase was observed in SMCs. The existence of this time interval suggests a chemical coupling between SMCs and ECs through gap junctions. Most probable chemical mediators are either calcium or inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3). To discriminate between calcium and IP3 diffusion, first a phospholipase C inhibitor was applied to prevent IP3 production in response to the calcium concentration increase in SMCs. Under this inhibitor and KCl, all SMCs presented a global and synchronous calcium concentration increase, but no calcium concentration variations in ECs were detected. Secondly, 2-Aminoethoxydiphenylborate, an inhibitor of IP3-induced calcium release, reduced the number of flashing ECs by 75±3 %. The number of flashing ECs was also significantly reduced when palmitoleic acid, a gap junction uncoupler was added. Our results were compatible with a heterocellular communication based on IP3 diffusion through gap junctions from SMCs to ECs. The last chapter summarizes our findings and provides our conclusions with some perspectives.
    Résumé
    Ce travail de thèse traite de la communication cellulaire dans la paroi artérielle en présence de vasomotricité, i.e. lors de variations rythmées et spontanées du diamètre artériel. La vasomotricité est corrélée aux variations du calcium des cellules musculaires lisses (SMCs) de la paroi. L'analyse de la dynamique du calcium dans les SMCs et les cellules endotheliales (ECs) individuelles est essentielle pour comprendre les mécanismes physiques à la base de la vasomotricité. Cette étude comporte deux volets expérimentaux réalisés sur des artères mésentériques de rat: une analyse du recrutement et de la synchronisation des SMCs et une analyse de la communication entre SMCs et ECs. L'introduction résume l'état des connaissances actuelles sur la vasomotricité et ses mécanismes. L'accent est mis plus particulièrement sur la dynamique du calcium et les communications homocellulaire entre SMCs, entre ECs et héterocellulaire entre SMCs et ECs. Le chapitre "matériel et méthodes" résume les techniques expérimentales utilisées pour mesurer la dynamique du calcium dans des SMCs et/ou des ECs par fluorescence d'un colorant. Nous avons utilisé des strips (artère ouverte) et des segments d'artères observés par microscopie confocale ou microscopie optique conventionnelle. Il est ainsi possible de corréler les variations de calcium dans des cellules individuelles avec les variations locales de la contraction de l'artère. Dans le chapitre 3, nous avons étudié le comportement de SMCs individuelles afin de vérifier si elles présentent les mêmes variations de concentration de calcium que celles du calcium moyen ou si, au contraire, la vasomotricité résulte d'une contribution inégale de chaque SMC. L'artère est stimulée par diverses concentrations de vasoconstricteurs, la phenylephrine (PE) et le chlorure de potassium (KCl). A faible concentration, seules quelques cellules présentent des variations asynchrones de calcium et aucune contraction n'est observée. A moyennes concentrations, un recrutement total et synchrone est observé, induisant une contraction dans le cas d'une stimulation au KCl et de la vasomotricité lors de stimulations à la PE. A haute concentration, les deux vasoconstricteurs induisent une contraction de l'artère. Le calcium oscille dans les SMCs, mais le niveau du calcium moyen reste suffisamment élevé pour que l'artère ne relaxe pas. Nous avons donc mis en évidence le recrutement et la synchronisation des SMCs et montré leur importance pour la contraction et la vasomotricité artérielle. Dans le chapitre 4, nous nous sommes intéressés aux trois principaux mécanismes possibles de synchronisation des SMCs lors d'une stimulation avec de la PE ou du KCl. Nous avons testé l'importance des canaux calciques dépendant du potentiel transmembranaire (VOCs: voltage-gated channels), c'est-à-dire de la communication électrique. Pour cela, des inhibiteurs des VOCs ont été utilisés. Nous avons également testé l'importance de la contraction des SMCs individuelles pour la synchronisation, ceci par l'intermédiaire des canaux calciques qui s'activent par l'étirement (SACs: stretch-activated channels). Trois inhibiteurs de la contraction agissant par différents mécanismes ont été utilisés. Finalement, nous avons analysé le rôle des jonctions communicantes dans la synchronisation des SMCs. Ces jonctions intercellulaires peuvent générer une communication chimique et/ou électrique. Nous avons utilisé un découpleur des jonctions communicantes et également des microinjections de colorant dans une cellule pour analyser la diffusion aux cellules voisines. Nos résultats tendent à montrer que lors d'une stimulation à la PE, la synchronisation du recrutement des SMCs s'effectue électriquement par jonctions communicantes. Dans le cas d'une stimulation au KCl, toutes les SMCs sont simultanément dépolarisées. Le calcium entre depuis le milieu extracellulaire par les VOCs et ne fait donc pas intervenir les jonctions communicantes. Lors des études sur le recrutement et la synchronisation des SMCs, nous avons parfois observé des vagues de calcium intercellulaire se propageant parallèlement à l'axe d'artères stimulées par de la PE. Dans le chapitre 5, nous avons utilisé un algorithme de tracking pour décrire et quantifier ces vagues. Nous avons notamment pu montrer que les vagues de calcium étaient corrélées aux vagues de contraction et qu'elles se déplaçaient à des vitesses similaires de l'ordre de 60 µm/s. La méthode de tracking développée ici ouvre de grandes perspectives pour l'étude des phénomènes cellulaires dans les artères. Elle présente l'avantage de pouvoir corréler les variations de contractions (et du mouvement) avec les variations de calcium. L'importance de l'endothelium pour la vasomotricité reste mal connue. Les SMCs et ECs sont couplées électriquement et chimiquement, permettant ainsi l'échange de signaux intercellulaires. Dans le chapitre 6, nous avons étudié la communication des SMCs aux ECs lorsqu'on stimmule les SMCs par de la PE et du KCl. Nous avons vérifié que ces deux vasoconstricteurs augmentent uniquement la concentration de calcium dans les SMCs et pas dans les ECs. Nous avons observé qu'une augmentation de calcium dans les SMCs est suivie d'une augmentation de calcium dans les ECs après un délai de l'ordre de 5 à 11 secondes. L'existence de cet intervalle suggère la diffusion d'un messager des SMCs aux ECs, probablement par jonctions communicantes. Les deux messagers les plus probables sont le calcium et l'inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3). Dans un premier temps, un inhibiteur de la phospholipase C dans les SMCs a été utilisé afin de voir si l'IP3 était la molécule diffusante. Dans ce cas aucune réponse dans les ECs n'a été observée. Nous avons ensuite appliqué un inhibiteur qui empêche l'IP3 de libérer du calcium du reticulum sarcoplasmique des ECs. Dans ce cas le nombre de ECs qui présentent une augmentation de calcium est réduit de façon significative. Il en est de même en présence d'un découpleur des jonctions communicantes. Nos résultats sont compatibles avec l'idée d'une communication des SMCs aux ECs par diffusion d'IP3 à travers les jonctions communicantes. Le dernier chapitre de ce travail résume les principaux résultats obtenus et contient nos conclusions ainsi que quelques perspectives.