Faculté des sciences de base SB, Section de chimie et génie chimique, Institut interfacultaire de Bioingénierie (SV/STI) IBI1 (Laboratoire de biotechnologie cellulaire (SV/STI) LBTC1)

Establishment of recombinant mammalian cell lines : new approaches

Derouazi, Madiha ; Wurm, Florian (Dir.)

Thèse sciences Ecole polytechnique fédérale de Lausanne EPFL : 2005 ; no 3150.

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    Summary
    Recombinant proteins are gaining in importance for therapeutic applications. The proteins are expressed in stable cell lines, within which recombinant DNA has incorporated into the host cells genome. Identification and isolation of extremely high producers from transfected cell populations is a tedious and time-consuming effort. We proposed two different approaches for the establishment of recombinant cell lines: affinity cell sorting and microinjection. Even with the help of single cell sorting and analysis systems (flow cytometry) rarely more than thousand different cell clones, stably expressing a desired gene can be evaluated. We are considering a new approach in which polyclonal cell populations will be established which co-express a protein of interest and an epitope-tagged cell surface receptor. A microbead fixed antibody specific to the epitope tag is hoped to assist in the isolation of rare, but highly productive cells from large suspensions of transfected cells. For this reason we have also developed an efficient method for the bulk transfection of CHO cells. On the side of vector-development for this approach, we have chosen to investigate the utility of a mouse serotonin 5-HT3 receptor as a cell surface marker. This receptor can be expressed at very high levels (up to 1 x 107 receptors per cell) in heterologous systems. The receptor is detectable on the cell surface by means of fluorescent ligands, which allows the determination of transfection efficiencies in suspension cultures. A Flag-tag was fused to the amino terminal end of the receptor without adverse effects on receptor function or ligand binding. Only 5 % of receptor DNA in the transfection cocktail was sufficient to detect positive cells in a population. The specific interaction of the epitope-tagged receptor with the cognate antibody fixed to microbeads was tested in comparison to non-transfected control cells using laser scanning confocal microscopy. A 80% enrichment of cells expressing GFP and the 5-HT3 receptor was achieved in 30 minutes. We have investigated microinjection as a gene transfer method for the establishment of recombinant mammalian cell lines. The conditions for the injection of plasmid DNA into either the nucleus or the cytoplasm of CHO-DG44 cells were established using pMYK-EGFP, an expression vector with the enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene under the control of the murine CMV promoter and the puromycin resistance gene for selection. To estimate plasmid copy number during microinjection, it was first necessary to determine the injection volume by fluorescence quantification of injected FITC-dextran. For microinjection into the cytoplasm the volume ranged from 200 to 350 fl and for nuclear microinjection it was about 180 fl. We then investigated the impact of DNA concentration and injection pressure on transient EGFP transient expression following microinjection into the cytoplasm or nucleus. As a general rule, we observed that concentration of the DNA solution injected into the cells was the most important parameter regardless of the pressure or the volume of injection. Recombinant cell lines expressing intracellular EGFP were established following microinjection into the nucleus and the cytoplasm with linear and circular DNA. Selection with puromycin, clonal expansion, and cell banking were completed within three to four weeks post-microinjection. In parallel, recombinant cell lines were established after calcium-phosphate transfection with linear and circular DNA. The number of plasmid copies integrated was determined by Southern blot and the number and localization of integration sites was determined by fluorescence in-situ hybridization (FISH). Growth of the cells and stability of EGFP expression were investigated by cultivation over a two-month period. This approach presents several advantages over other DNA delivery methods such as control of the quantity and localization of DNA delivered into the cell and speed of recovery of recombinant cell lines. This approach may be relevant for the establishment of recombinant cell lines from cells that are not easily transfected by classical methods.
    Zusammenfassung
    Rekombinante Proteine werden immer wichtiger für therapeutische Anwendungen. Diese Proteine werden oft in stabilen Zelllinien exprimiert, in deren Genom rekombinante DNS eingebracht wurde. Die Identifikation und das Isolieren von Zellen, die das Protein gut produzieren, aus einer Population transfizierter Zellen ist mühsam und zeitaufwendig. In dieser Arbeit werden zwei alternative Verfahren für die Etablierung von stabilen Zelllinien vorgeschlagen: "Affinity cell sorting" und Microinjektion. Selbst mit der Hilfe von Flusszytometern und Zellsortern ist es oft unmöglich mehr als tausend verschiedene Zellklone auf eine gewünschte Genexpression zu untersuchen. Wir stellen in dieser Studie eine neue Strategie vor. Es werden polyklonale Zellpopulationen generiert die neben dem Nutzprotein zusätzlich auch noch ein spezifisches Oberflächen-Epitop exprimieren. Zellen, die nun das Epitop überexprimieren, können dann mit spezifischen Antikörper, die ihrerseits an magnetischen Microbeads haften, gefischt und angereichert werden. Es gilt die raren ‘Superproducer’ Zellen zu finden. In einem ersten Schritt wurde eine hocheffiziente Transfektionsmethode für CHO Zellen in Suspension entwickelt. Als Epitop-Marker wurde ein Maus Serotonin 5-HT3 mit Flag-tag verwendet. Dieser Rezeptor wird von CHO sehr gut exprimiert (bis 1 x 107 Rezeptoren pro Zelle) und kann mit fluoreszenten Liganden detektiert werden. Dies erlaubt die Transfektionseffizienz in Suspensionskulturen zu messen. Das an den Aminoterminus fusionierte Flag-tag zeigte keinen negativen Effekt auf die Funktion oder das Bindungsverhaltern des Rezeptors. 5 % Rezeptor DNS im Transfektionscocktail genügten um positive Zellen zu identifizieren. Die spezifische Interaktion des mit dem Epitop markierten Rezeptors und des konjugierten Antikörpers wurde gegen nicht exprimierende Zellen mit Hilfe eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopgetestet. Mit dieser Methode war es möglich in 30 Minuten alle nicht-exprimierenden Zellen zu verwerfen und 80% der hoch-exprimierenden Zellen anzureichen. Weiter wurde die Mikroinjekton als Gentransfer-Methode für das Etablieren von rekombinanten Säugetier Zelllinien untersucht. pMYK-EGFP, ein Expressionsvektor für EGFP (enhanced green fluorescent protein) mit einem murine CMV-Promoter und einer Puromyzinresistanz, wurde in den Kern und das Zytoplasma von CHO DG44 Zellen injiziert. Es wurde sowohl lineare als auch zirkulare Plasmid DNS verwendet. Mit FITC-Dextran Injektionen und Fluoreszenzmessungen wurde das Injektionsvolumen gemessen, um so die injizierte Plasmidkopienzahl zu ermitteln. Für das Zytoplasma wurden Injektionsvolumina von 200 bis 350 fl gefunden, für Kernmikroinjektionen waren es um die 180 fl. Im Weitern wurde der Einfluss der DNS-Konzentration und des Injektionsdruckes auf die transiente GFP-Expression untersuch. Dabei stellte sich heraus, dass die Konzentration der injizierten DNS den wichtigsten Parameter, unabhängig von Druck und Injektionsvolumen, darstellt. Transfektion mit Mikroinjektion, Selektion, Klonierung und das Erstellen einer Zellbank dauerten nur 3 bis 4 Wochen. Zum Vergleich wurden Zelllinien mit klassischer Kalzium-Phosphat-Transfektion erstellt. Mit Hilfe von Southern Blots wurden die Kopienzahl des rekombinanten DNS im und mit FISH (fluorescence in- situ hybridization) deren Lokalisierung auf dem Genom ermittelt. Zellwachstum und GFP-Expressionsstabilität wurden mit einer zweimonatigen Dauerkultur überprüft. Die Mikroinjektion hat gegenüber allen andern Transfektionsmethoden mehrere Vorteile, so können Volumen und der Ort der DNS-Injektion bestimmt werden, weiter wird das Isolieren von so entstandenen Zellklonen erleichtert und beschleunigt. Diese Technik könnte für das Etablieren von Zelllinien, die bis dato mit klassischen Methoden als schwer transfizierbar galten, grosse Bedeutung gewinnen.
    Résumé
    Les protéines recombinantes deviennent de plus en plus importantes pour les applications thérapeutiques. Les protéines sont exprimées dans des lignées cellulaires stables, dans lesquelles un ADN recombinant a été incorporé au génome de la cellule hôte. L'identification et l'isolation de clones grands producteurs, au sein d'une population transfectée, est un travail pénible et de longue haleine. Nous proposons deux approches pour l'établissement de lignées cellulaires recombinantes : le tri cellulaire par affinité et la micro-injection. Même avec l'aide d'un tri individuel des cellules et un système d'analyse, tel que la cytométrie en flux, il reste très rare de pouvoir analyser plus d'un millier de clones, exprimant de manière stable le gène désiré. Nous nous intéressons à une nouvelle approche qui consiste en l'établissement de populations de cellules poly-clonales, qui co-expriment une protéine d'intérêt et un récepteur cellulaire de surface, marqué avec un épitope. L'utilisation de microbilles, sur lesquelles sont fixés des anticorps spécifiques de l'épitope, permet l'isolation de cellules rares mais très hautes productrices, à partir d'une grande population de cellules transfectées. C'est pour cette raison, que nous avons aussi développé une méthode efficace de transfection, adaptée aux cellules CHO en suspension. Nous avons choisi d'étudier l'apport d'un récepteur 5HT3 de souris à la sérotonine en tant que marqueur de la surface cellulaire. Ce récepteur peut être exprimé à un niveau très élevé (jusqu'à 107 récepteurs par cellules) dans des systèmes hétérologues. Le récepteur est détectable à la surface de la cellule à l'aide de ligands fluorescents, ce qui permet de déterminer l'efficacité de la transfection sur des cultures en suspension. Un marqueur FLAG a été fusionné à l'extrémité N-terminale du récepteur, sans effets adverses sur sa fonction ou sa capacité à s'associer à un ligand. Seulement 5%, dans le cocktail de transfection, d'ADN, codant pour le récepteur, sont suffisants pour détecter des cellules positives au sein d'une population. L'interaction spécifique entre le récepteur marqué avec l'épitope et l'anticorps apparenté, fixé sur les microbilles, a été testée, en comparaison de cellules contrôles non transfectées, en utilisant la microscopie confocale à balayage laser. Un enrichissement à hauteur de 80%, de cellules exprimant la GFP et le récepteur 5HT3, a été réalisé dans un délai de 30 minutes. Nous avons testé la micro-injection comme méthode de transfert de gène pour l'établissement de lignées de cellules recombinantes de mammifères. Les conditions, pour l'injection de plasmide à ADN dans le noyau ou le cytoplasme des cellules CHO-DG44, ont été établies en utilisant le pMYK-EGFP, un vecteur d'expression avec le gène de la GFP améliorée (EGFP) sous contrôle du promoteur murin CMV et du gène de résistance à la puromycine pour la sélection. Pour estimer le nombre de copies du plasmide durant la micro-injection, il était d'abord nécessaire de déterminer le volume d'injection par quantification de la fluorescence après injection de dextran couplé au FITC. Pour la micro-injection dans le cytoplasme, le volume était de 200 à 350 femtolitres et de 180 femtolitres dans le noyau. Nous avons ensuite étudié l'impact de la concentration en ADN et de la pression d'injection sur l'expression transitoire d'EGFP, consécutivement à une micro-injection dans le cytoplasme ou le noyau. En règle générale, nous avons constaté que la concentration en ADN, de la solution injectée dans la cellule, était le paramètre le plus important en regard de la pression ou du volume d'injection. Des lignées de cellules recombinantes, exprimant l'EGFP de manière extracellulaire, ont pu être établies après injection d'ADN linéaire et circulaire dans le noyau et le cytoplasme. Une sélection à la puromycine, une expansion clonale et la constitution d'une banque de cellules ont été accomplies en trois à quatre semaines après la micro-injection. En parallèle, des lignées de cellules recombinantes ont été établies après transfection au calcium-phosphate avec de l'ADN linéaire et circulaire. Le nombre de copies de plasmide intégrées a été déterminé par « Southern blot » et le nombre de sites d'intégration et leur localisation l'a été par hybridation de sondes fluorescentes in situ (technique FISH). La croissance des cellules et la stabilité d'expression de l'EGFP ont été étudiées sur les cellules en culture durant une période de deux mois. Cette approche présente plusieurs avantages, en comparaison d'autres méthodes de transfection, comme le contrôle de la qualité de l'ADN administré et sa localisation dans la cellule ou encore la vitesse d'obtention de lignées de cellules recombinantes. Cette manière d'aborder le problème peut s'avérer approprié pour l'établissement de lignées de cellules recombinantes, à partir de cellules qui ne sont pas aisément transfectables par les méthodes classiques.