Faculté des sciences de base SB, Section de chimie et génie chimique, Institut des sciences et ingénierie chimiques ISIC (Laboratoire de chimie physique des polymères et membranes LCPPM)

In vivo protein labeling for structural and functional investigation of the 5-HT3A neurotransmitter receptor

Ilegems, Erwin ; Vogel, Horst (Dir.)

Thèse sciences Ecole polytechnique fédérale de Lausanne EPFL : 2004 ; no 3016.

Ajouter à la liste personnelle
    Summary
    In this thesis, two different fluorescent labeling techniques for in vivo investigations on the 5-HT3 receptor (5-HT3R) functions are presented. This plasma membrane protein contains five subunits surrounding an ion channel that opens after binding of a 5-HT3-specific neurotransmitter. The first technique, described in the first part of this report, focuses on receptor labeling via genetic fusion to spectral variants of the green fluorescent protein. I found that the resulting chimeras containing one fluorescent protein per subunit exhibit preserved ligand binding and channel activity, opening a wide range of biological research applications. Among these, I present the possibility to follow the 5-HT3R trafficking and localization during its entire life cycle by multicolor imaging in live cells, starting with its cytoplasmic biogenesis and ending with its ligand-induced internalization. The intracellular subunit assembly is shown to occur in the endoplasmic reticulum, and the importance of the cytoskeleton microtubules for proper membrane targeting is unraveled. The utility of bioluminescent 5-HT3R contructs was also demonstrated in another approach using the chemical disruption of cellular actin filaments to produce vesicular fractions of cells, in the order of 0.1 to a few micrometers in diameter. These so-called native vesicles, containing the labeled receptors in their membrane, were shown to be suitable for measurements using fluorescence confocal microscopy of ligand binding and of ion influx, opening new possibilities for miniaturized bioanalytics. In a third approach, I demonstrated that after detergent-solubilization of the receptor, the green fluorescent protein (GFP) inserted into the receptor sequence permitted to monitor ligand binding via fluorescence resonance energy transfer (FRET). Furthermore, I could observe a spatial reorientation of the receptor GFPs upon binding an agonist to the receptor. In the second part of this thesis, I adapted the mis-acylated suppressor tRNA technology to mammalian cells, permitting the introduction of unnatural amino acids at specific positions in the protein of interest. I achieved an efficiency of amino acid incorporation using in vitro aminoacylated suppressor tRNA in the order of 15% in CHO cells. A novel methodology for the quantification of background natural nonsense codon readthrough in different cell lines was also developed, permitting to select the most suitable codon-anticodon pair for this suppressor tRNA technique in various cell lines. Finally, I present a general strategy to increase the aforementioned artificial incorporation efficiency by down-regulating the competing eukaryotic release factor 1 (eRF1) using small interfering RNAs.
    Résumé
    Dans le cadre de cette thèse, je présente deux techniques de marquage de protéines par fluorescence, afin d'étudier in vivo les fonctions du récepteur de la sérotonine 5-HT3 (5-HT3R). Cette protéine membranaire contient cinq sous-unités formant un canal ionique dont l'ouverture est induite par la fixation d'un neurotransmetteur spécifique au 5-HT3R. La première technique, décrite dans la première partie de cette thèse, consiste au marquage du récepteur par fusion génétique à une protéine fluorescente. J'ai développé des chimères du 5-HT3R contenant une protéine fluorescente (GFP) par sous-unité, et qui conservent leurs fonctionnalités biologiques de fixation de ligand et de canal ionique. L'addition d'une dimension visuelle à ce récepteur permet une grande variété d'expériences, parmi lesquelles je présente la possibilité de suivre en détail son cycle de vie, de l'assemblage de ses cinq sous-unités dans le réticulum endoplasmique, sa disposition sur la membrane cellulaire, jusqu'à son internalisation induite par un ligand. L'imagerie multicolore par microscopie confocale permet en outre de dévoiler l'importance du cytosquelette pour le transport du récepteur vers la membrane et sa répartition. La destruction partielle des filaments d'actine engendre la production de fractions de cellules sous forme de vésicules de diamètres s'échelonnant entre 0.1 et quelques micromètres. La fluorescence émise par la GFP attachée au 5-HT3R permet d'observer que ces "vésicules natives" contiennent à leur surface les protéines membranaires originant de la cellule. Je montre que l'activité ionique liée à ces récepteurs peut être mesurée par fluorescence sur les vésicules, et que ces dernières peuvent potentiellement remplacer les cellules entières pour analyser les fonctions de base du récepteur. Je démontre également que la fixation extracellulaire d'un ligand sur le récepteur induit un changement de conformation transmembranaire du récepteur mesurable par la fluorescence des protéines de marquage situées dans le domaine intracellulaire du récepteur. Dans la deuxième partie de cette thèse, j'étudie une technique basée sur l'utilisation d'ARNt suppresseurs mis-acylés permettant l'incorporation d'acides aminés artificiels fluorescents dans une protéine. Je parviens à adapter cette technique à une utilisation dans des cellules CHO, et obtiens une efficacité d'incorporation de l'ordre de 15%. Une méthode originale est également développée afin de quantifier dans différentes cellules la suppression naturelle, permettant de définir pour chaque lignée cellulaire la paire codon-anticodon la mieux adaptée à la technique d'ARNt suppresseur. Finalement, je présente une nouvelle stratégie permettant d'améliorer l'efficacité d'incorporation d'acides aminés artificiels en diminuant in vivo la quantité d'eRF1 par le biais d'ARN interférents.