Faculté de l'environnement naturel, architectural et construit ENAC, Section des sciences et ingénierie de l'environnement, Institut des sciences et technologies de l'environnement ISTE (Laboratoire de biotechnologie environnementale LBE)

Assessment of microbial community changes and limiting factors during bioremediation of hydrocarbon-polluted soil with new miniaturized physiological methods

Kaufmann, Karin ; Holliger, Hans Christof (Dir.)

Thèse sciences Ecole polytechnique fédérale de Lausanne EPFL : 2004 ; no 2972.

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    Due to human activities, organic pollutants are spilled to the environment where they threaten public health, often as contaminants of soil or groundwater. Living organisms are able to transform or mineralize many organic pollutants, and bioremediation techniques have been developed to remove pollutants from a contaminated site. However, fast and easy methods to document both the efficacy of bioremediation and the changes in soil microbial communities during bioremediation are not well developed. The major aim of this thesis was to develop miniaturized methods targeting the physiology of microbial communities during pollutant degradation in soil and to assess pollution-induced community changes. Furthermore, the methods should identify factors limiting efficient pollutant biodegradation. Petroleum hydrocarbons have been chosen as pollutants because these compounds are frequently spilled, readily water-soluble, partly toxic and carcinogenic, and therefore undesirable in soils and drinking water supplies. The influence of petroleum hydrocarbons on a microbial community in the vadose zone was assessed under field conditions. An artificial hydrocarbon mixture consisting of volatile and semi-volatile compounds similar to jet-fuel was emplaced in a previously uncontaminated vadose zone in nutrient-poor glacial melt water sand. The experiment included monitoring of microbial parameters and CO2 concentrations in soil gas over 3 months, in- and outside the hydrocarbon vapor plume that formed around the buried petroleum. Microbial and chemical analyses of vadose zone samples were performed on material from 9 cores drilled on 3 days at 3 distances from the buried petroleum mass to 3.3 m depth. Significantly elevated CO2 concentrations were observed after contamination. Total cell numbers as determined by fluorescence microscopy were strongly correlated with soil organic carbon and nitrogen content but varied little with contamination. Redundancy analysis (RDA) allowed direct analysis of effects of selected environmental variables or the artificial contamination on microbiological parameters. Variation in biomass and CO2 production was to 46 % explained by soil parameters and to 39.8 % by the duration of contamination. The microbial community structure was assessed by community-level physiological profile analysis using BiologTM EcoPlates. Only 35.9 % of variation in BiologTM data could be attributed to soil parameters and contamination, however, the samples with greatest exposure to hydrocarbons grouped together on RDA plots. It is concluded that at this nutrient-poor site, the microbial community was dominated by the natural heterogeneity and that the influence of petroleum hydrocarbon vapor was weak. BiologTM Eco-Plates combined with RDA were able to distinguish between samples with high and low hydrocarbon exposure. However, the method was not sensitive enough to produce consistent patterns in three replicates when extracts from subsurface soils with low cell numbers were inoculated. A more sensitive, MPN-based system was therefore developed and its ability to provide information about specific pollutant degraders was tested in alluvial sand. Eight dilutions of sand extracts were inoculated on medium- and substrate-containing polypropylene deep-well plates. To keep the concentrations of the volatile substrates constant over several days of incubation without intoxicating the soil community, a substrate-containing organic carrier phase was applied to each vial. The biochemically inert 2,2,4,4,6,8,8-heptamethylnonane (HMN) was appropriate for this purpose. Thus, the volatile substrates partition from HMN into the microorganism-containing soil water where they achieve relatively low concentrations. The sensitive watersoluble tetrazolium dye (WST-1) was added to each well after 7 days incubation to detect dehydrogenase activity. A dark yellow signal was developed for the substrates toluene, n-octane, n-dodecane, 1,2,4-trimethylbenzene and methylcyclohexane but not for isooctane, being strongest in n-alkane amended wells. With this method, more hydrocarbon degrading bacteria were detected in an alluvial sand exposed to kerosene for 72 hours compared to the community in the pristine sand. Both communities were mainly composed of n-alkane degraders. Although encouraging results were achieved, we noticed that the tetrazolium reduction was inhibited in some cases. Wells with high cell numbers, in which obvious growth occurred, did not produce a signal. In a next step, the two-liquid phase system with HMN was applied to modify a miniaturized respiration detection system using whole soil samples instead of soil extracts (Campbell et al., AEM 69, p. 3593). Soil was incubated in deep-well plates in presence of single volatile organic hydrocarbons. The carrier phase was added to the interstitial space in a bead layer on the bottom of the well (below the soil sample), and the hydrocarbons diffused into the soil-water. The soil activity was determined by means of an agar plate containing a pH indicator, which changes color as a function of the produced CO2. Physiological profiles specific to petroleum hydrocarbons in pristine and contaminated soils were assessed. The substrate concentrations, which induced highest microbial activity, as well as concentrations causing inhibition, were determined with effect-concentration curves. Community-level physiological profiles based on hydrocarbon degradation were obtained by applying multivariate analysis on the CO2 yields. The first measurement period of 0-6 hours after addition of relatively high hydrocarbon concentrations to the system yields values, which best separated soil types as well as pristine and contaminated soils. If low concentrations were applied, we obtained only significant separations after 24 hours incubation, probably after a growth step. The same micro-respiration system equipped with a 14CO2 detection plate was applied to study N and P limitation of aerobic mineralization of 14C-toluene in a soil previously exposed to petroleum. Significant nutrient limitation during short-term tests (24-48 hours) was identified and the optimized combination of nutrient addition was determined. Conclusively, miniaturized physiological methods have been proven to detect soil microbial community changes in petroleum hydrocarbon-contaminated soils. Adding an organic carrier phase to the miniaturized systems allowed assuring a volatile organic hydrocarbon supply in non-toxic concentrations in the soil water or the medium for several days. Thus simple, cost-effective systems to investigate the soil community during bioremediation and to address questions of nutrient shortage in soils have been provided with this thesis.
    La contaminantion du sol et des nappes phréatiques par des polluants organiques liée aux activités humaines met en danger la santé publique. Certaines souches microbiennes capables de transformer ou de minéraliser des polluants organiques sont à l'origine du développement des techniques de bioremédiation pour la dépollution des sites contaminés. Cependant des méthodes simples et rapides à mettre en oeuvre pour évaluer l'efficacité de la bioremédiation et les changements dans la communauté bactérienne dus à la bioremédiation sont rares. Le but principal de cette thèse était de développer une méthode physiologique miniaturisée afin d'évaluer les changements de la communauté bactérienne suite à la bioremédiation. De plus, la méthode devrait aussi permettre de détecter des facteurs limitants l'efficacité de la biodégradation. Des hydrocarbures de pétrole ont été choisis comme polluants dans cette recherche parce qu'ils sont fréquemment déversés dans l'environnement, bien qu'en raison de leurs bonnes solubilités dans l'eau, de leur toxicité ou du fait qu'ils soient carcinogènes, ces polluants sont indésirables dans l'eau. L'influence des hydrocarbures de pétrole sur la communauté bactérienne dans la zone non saturée a été étudiée sur le terrain. Un mélange artificiel d'hydrocarbures volatiles et semivolatiles, semblable au kérosène, a été introduit dans une zone auparavant non contaminée. Le sol était un sable formé par de l'eau de fonte de glace pauvre en nutriments. L'expérience a consisté à mesurer pendant trois mois les paramètres microbiens et les concentrations de CO2 dans l'air du sol, à l'intérieur et à l'extérieur du panache, qui s'est formé autour de la source d'hydrocarbures enfouie dans le sol. Des analyses microbiologiques et chimiques du sol ont été réalisées sur neuf carottes prélevées à trois dates, trois distances différentes de la source et à une profondeur de 3.3 m. Les concentrations de CO2 ont augmenté significativement après la contamination. Le nombre des cellules, déterminé par microscopie à fluorescence, était fortement corrélé avec le taux de matière organique et la quantité d'azote total, mais variaient peu avec la contamination. L' analyse de redondance (redundancy analysis) (RDA) a permis de lier les effets des variables environnementales ou de la contamination artificielle avec les paramètres microbiens. La variation de biomasse et de production de CO2 était expliquée à 46 % par les paramètres du sol et à 39.8 % par la durée de la contamination. La structure de la communauté microbienne dans ce sol a été déterminée par l'analyse des profils physiologiques au niveau de la communauté (CLPP) en utilisant des plaques BiologTM (EcoPlates). Seuls 35.9 % de la variation des CLPPs pouvaient être attribués aux paramètres du sol et à la contamination; cependant les échantillons qui ont été exposés aux plus grandes concentrations de polluants étaient regroupés par la RDA. Il en a été conclu que la communauté microbienne de ce site pauvre en nutriments est principalement influencée par l'hétérogénéité naturelle du sol et que l'influence des vapeurs d'hydrocarbures de pétrole est faible. L'utilisation de plaques BiologTM combinée avec la RDA a permis de différencier les échantillons qui ont été exposés aux hautes concentrations d'hydrocarbures de ceux qui ont été exposés à des concentrations basses. Pourtant la méthode n'était pas assez sensible pour produire trois replicats cohérents lorsque des extraits du sol de la subsurface, contenant peu de microorganismes, étaient inoculés sur les plaques. Un procédé plus sensible basé sur la méthode du nombre le plus probable (MPN) a été développé, afin d'obtenir des informations spécifiques sur le nombre de microorganismes capables de dégrader certaines polluants dans un sable alluvial. Un extrait du sable a été inoculé sur une plaque de polypropylène aux puits profonds contenant un milieu de croissance et un substrat. Une phase organique, le 2,2,4,4,6,8,8-heptaméthylnonane (HMN) substance biochimiquement inerte, servant de réservoir a ensuite été ajoutée à chaque puits afin de conserver la concentration des substrats volatils constante pendant plusieurs jours sans intoxiquer les microorganismes. Les substrats volatiles diffusent de l'HMN vers la phase aqueuse contenant les microorganismes, où ceux-ci sont exposés à des concentrations d'hydrocarbures relativement basses. Un tetrazolium sensitive (WST-1), soluble dans l'eau, a été ajouté dans chaque puits après sept jours d'incubation pour détecter l'activité des deshydrogénases. Un signal a été développé dans tous les puits sauf dans ceux ayant comme substrat l'isooctane. Le signal le plus fort a été produit par les microorganisms croissant sur des n-alcanes. Cette méthode a permis de mesurer une augmentation du nombre de bactéries capables de dégrader des hydrocarbures dans le sable contaminé par rapport au sable non-contaminé. Les communautés bactériennes des deux sables étaient dominées par des organismes dégradant les n-alcanes. Même si les résultats obtenus avec la méthode WST-MPN étaient encourageants, il a été noté que la réduction du tetrazolium était inhibée dans certains cas. Les puits dans lesquels une croissance a pu être observée n'ont pas produit de signal. Dans l'étape suivante, la technique du réservoir organique (HMN) a été appliquée dans un système de micro-respiration, dans lequel des échantillons de sol entier sont utilisés à la place d'extraits de sol (Campbell et al., AEM 69 p. 3593). A nouveau, le sol a été incubé dans des plaques aux puits profonds en présence d'un seul hydrocarbure volatile organique, à la différence que le réservoir organique a été pipeté dans l'espace interstitiel d'une couche de billes placées au fond de chaque puit. Dès ce moment-là, le composé organique a diffusé dans la solution du sol. Dans ce système l'activité microbienne du sol peut être mesurée avec un agar auquel un indicateur pH détectant la production du CO2 a été ajouté. Des profils physiologiques spécifiques aux hydrocarbures ont été déterminés dans des sols contaminés et non-contaminés. Avec des courbes d'effets des substances en fonction de la concentration, les concentrations qui induisaient la plus grande activité microbienne et celles qui causaient une inhibition ont pu être mises en évidence. Des CLPP ont été obtenus en appliquant une analyse multivariée aux concentrations de CO2 produits lors de la dégradation des substrats. Les mesures sur la première période de 0-6 heures après l'ajout des concentrations élevées d'hydrocarbures dans les puits ont montré la meilleure séparation entre les différents types du sol et entre les sols contaminés et non-contaminés. Lorsque des concentrations basses d'hydrocarbures ont été appliquées, les types de sols ne pouvaient être distingués uniquement après 24 heures d'incubation, qui correspond probablement à une phase de croissance des microorganismes. Le même système de micro-respiration, cette fois-ci équipé d'une plaque de détection du 14CO2, a été mis en oeuvre afin d'étudier les limitations liées à P et N de la minéralisation en aérobie de 14C-toluène dans un sol contaminé. Des limitations dues aux nutriments ont été identifiées pendant des tests de courte durée et une combinaison de nutriments optimale pour ce sol a pu être déterminée. En conclusion, il a été prouvé que des méthodes physiologiques miniaturisées sont des outils performants de détection des changements survenant dans les communautés microbiennes des sols contaminés par des hydrocarbures de pétrole. L'ajout d'un réservoir organique dans le système a permis d'assurer un approvisionnement en hydrocarbures dans la solution du sol en concentrations non-toxiques pendant quelques jours. Cette thèse a permis de mettre en place des systèmes simples et rentables afin d'étudier la communauté bactérienne durant la bioremédiation, permettant également de répondre aux questions concernant les limitations nutritives dans les sols.