Faculté de l'environnement naturel, architectural et construit ENAC, Section des sciences et ingénierie de l'environnement, Institut des sciences et technologies de l'environnement ISTE (Laboratoire de pédologie LPE)

Analysis of microbial community structures and functions in heavy metal-contaminated soils using molecular methods

Gremion, Fabienne ; Harms, Hauke (Dir.)

Thèse sciences Ecole polytechnique fédérale de Lausanne EPFL : 2003 ; no 2862.

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    Summary
    The contamination of agricultural land and groundwater by heavy metals is essentially linked to human activities. A major problem with heavy metals is that they cannot be biodegraded and therefore reside in the environment for long periods of time if they are not removed. Thus, depending of the kind and depth of contamination, different remediation techniques were developed. One of these methods, called "phytoextraction", uses the ability of so-called hyperaccumulating plants to extract high amounts of heavy metals. Accumulation of heavy metals in the environment is a serious concern for animal and human health. At the microscopic scale, heavy metals may have also deleterious effects on bacteria which are the key-players of the different nutrient turnovers in soils. Consequently, ecosystem functioning can be seriously perturbed and the long-term soil fertility may be threatened. The recent development of molecular biology greatly contributed to the discovery of the microbial diversity and its function in the soil. However, to date only a small number of studies used molecular methods to investigate the impacts of heavy metals on the bacterial community. In this thesis, a pot experiment was conducted under controlled conditions with one hyperaccumulating plant (Thlaspi caerulescens) grown in two different soils, a long-term and an artificially heavy metal-contaminated soil. The impact of heavy metals on the microbial community was then investigated with several molecular methods. Moreover, the decrease of the bioavailable heavy metals concentrations in soil due to plant uptake allowed to study the consequences on bacterial community structure and function. Based on the 16S ribosomal RNA and the corresponding gene (16S rDNA), four clone libraries were constructed to retrieve information on the structure of the microbial community and the potentially active part of the microbial community in the rhizosphere of Thlaspi caerulescens grown during three months in a long-term contaminated soil. The data obtained with the two clone libraries (rRNA and rDNA) from the rhizosphere of Thlaspi caerulescens were compared with the bulk soil data to identify any effect of the plant on the soil microbial community structure. Partial sequence analysis of 282 clones revealed that most of the environmental sequences in both soils affiliated with five major phylogenetic groups, the Actinobacteria, α-Proteobacteria, β-Proteobacteria, Acidobacteria and the Planctomycetales. The taxa dominating the bacterial community structure in the bulk soil also dominated the rhizosphere community, indicating that the plant did not exert a major influence on the overall bacterial diversity. However, all dominant taxa, with the exception of the Actinobacteria, were relatively less represented in the rRNA libraries as compared to the rDNA libraries. On the contrary, sequences belonging to the Actinobacteria dominated both bulk and rhizosphere soil libraries derived from rRNA. Seventy per cent of these clone sequences were related to two subgroups of the Rubrobacteria, which was an indication that this group of bacteria was probably metabolically active in heavy metal-contaminated soils. Fluorescence in situ hybridization (FISH) was used for the in situ detection and quantification of selected bacterial groups previously detected in the clone libraries from the rhizosphere of Thlaspi caerulescens. By applying the most general probe EUB338, only 20% of the total rhizosphere microbial community could be detected. Based on this result, it was difficult to conclude with certitude which were the most dominant bacteria in the rhizosphere. However, despite this low detection rate, it was possible to detect the major groups present in the rhizosphere clone libraries using group-specific oligonucleotide probes. As part of our sequences were affiliated to two emerging bacterial groups, the Acidobacteria and the Rubrobacteria, two new probes were designed, Acido228 (specific for the subgroup 1 of the Acidobacterium division) and Rubro198 (specific for the all Rubrobacteria subclass), for the detection of these microorganisms. These two probes were first checked for their specificity with pure cultures and finally applied in the rhizosphere soil allowing for the first time the detection of these organisms in situ. Finally, the impact of heavy metals and a subsequent one-year phytoextraction with Thlaspi caerulescens on the soil microbial community was investigated in an artificially heavy metal-contaminated soil. All the different molecular and culture-dependent techniques used, denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), community level physiological profile (CLPP) and potential ammonium-oxidation measurement showed that the heavy metal addition induced drastic changes in the bacterial community. Moreover, the analysis of the different bacterial DGGE patterns (Bacteria, β-Proteobacteria and ammonia-oxidising bacteria) obtained during this experiment showed that one-year phytoremediation was not sufficient to recover the initial community present in the non-contaminated soil. However, with the CLPP analysis, it was possible to detect a stimulating effect of the plant on a part of the microbial community in both contaminated and non-contaminated soils. The most obvious result was obtained in the contaminated soil where the number of substrates metabolised increased significantly in the presence of the plant as compared to the unplanted contaminated samples. The measurement of the potential ammonium-oxidation was used as a criterion for soil quality. Although this test showed that the ammonia-oxidising bacteria were significantly stimulated in the planted non-contaminated soil samples, the positive effect of the plant on these bacteria was not sufficient to overcome the inhibition induced by the presence of the heavy metals in the contaminated soil, even after one year phytoremediation. To conclude, molecular methods in combination with culture-dependent techniques have proven in this study to be very useful for the detection of the changes induced by the heavy metals in the structure and the function of the microbial community. Moreover, the molecular techniques contributed to the identification of bacteria which could be potentially used for the bioremediation of contaminated soils thus offering new perspectives of investigation and technology development.
    Résumé
    La présence de métaux lourds dans les terres agricoles et les nappes phréatiques est essentiellement liée à l’activité humaine. Les métaux lourds n’étant pas biodégradables, il a fallu développer différentes techniques pour décontaminer les sites pollués. L’une d’elles, la phytoextraction, exploite les propriétés hyperaccumulatrices de certaines plantes qui peuvent extraire de grandes quantités de métaux lourds. L’accumulation des métaux lourds dans l’environnement peut se répercuter sur la santé des êtres humains et des animaux. A l’échelle microscopique, les métaux lourds ont aussi des effets néfastes sur les populations bactériennes ce qui n’est pas sans conséquences sur le fonctionnement de l’écosystème. En effet, les micro-organismes occupent des positions clés dans les cycles des bioéléments. Leur disparition ne permet donc plus de garantir à long terme la fertilité du sol. Ces dernières années, le développement de la biologie moléculaire a largement contribué à la découverte de la diversité microbienne et de son rôle dans le sol. Cependant, à ce jour, peu d’études ont utilisé des méthodes moléculaires pour mesurer l’impact des métaux lourds sur les populations bactériennes. Dans le cadre de cette thèse, une expérience en pots a été menée en laboratoire avec une plante hyperaccumulatrice (Thlaspi caerulescens) plantée dans deux sols contaminés différemment, soit par l’ajout d’une poudre de métaux lourds ou par l’application de boues d’épuration durant plusieurs années. L’impact des métaux lourds sur les populations bactériennes a ensuite été évalué par le biais de différentes méthodes moléculaires. Dans un deuxième temps, l’utilisation de Thlaspi caerulescens a permis de diminuer les concentrations biodisponibles de métaux lourds dans le sol et d’en étudier les conséquences sur la structure et les fonctions de la communauté bactérienne. La création de banques de clones, basées sur l’ADN et l’ARN ribosomal bactérien (16S), a tout d’abord permis de déterminer la structure de la communauté microbienne et d’identifier les populations actives dans la rhizosphere de Thlaspi caerulescens qui avait été planté durant trois mois dans le sol contaminé naturellement. Par la suite, la comparaison des banques de clones obtenues à partir de l’ADN et de l’ARN du sol rhizosphérique avec celles du sol distant a permis de vérifier si la plante influençait la composition de la communauté microbienne. Le séquençage partiel de 282 clones a révélé que la plupart des séquences obtenues à partir du sol rhizosphérique et distant étaient affiliées à 5 grands groupes phylogénétiques, les Actinobacteria, α-Proteobacteria, β-Proteobacteria, Acidobacteria et les Planctomycetales. La prédominance de ces taxa, aussi bien dans la communauté microbienne du sol rhizosphérique que dans celle du sol distant, a montré que la plante avait une influence minime sur la structure générale de la communauté bactérienne. Cependant, à l’exception des Actinobacteria, les quatre autres taxa étaient généralement moins représentés dans les banques de clones basées sur l’ARN ribosomal que dans celles basées sur l’ADN. Au contraire, les séquences affiliées aux Actinobacteria prédominaient largement dans les banques de clones du sol distant et rhizosphérique construites à partir de l’ARN ribosomal. Plus précisément, 70% de ces séquences ont été apparentées à deux sous-groupes des Rubrobacteria, indiquant que ce groupe de bactéries était probablement actif dans les sols contaminés aux métaux lourds. L’hybridation in situ par fluorescence (FISH) a été utilisée pour détecter et quantifier in situ les différents groupes bactériens présents dans la rhizosphère de Thlaspi caerulescens et précédemment identifiés avec les banques de clones. Seulement 20% de la communauté rhizosphérique a pu être détectée avec la sonde la plus générale (EUB338) empêchant par conséquent de conclure avec certitude quelles étaient les populations microbiennes les plus dominantes dans la rhizosphère. Malgré cette limite de détection très basse, il a quand même été possible de détecter les groupes qui dominaient auparavant dans les banques de clones grâce à l’usage de sondes spécifiques. Pour les Acidobacteria et les Rubrobacteria, deux groupes relativement récents, il a fallu développer deux nouvelles sondes, Acido228 (spécifique au sous-groupe 1 de la division) et Rubro198 (spécifique à toute la sous-classe), pour pouvoir détecter les micro-organismes dont les séquences avaient été retrouvées dans les banques de clones. Après avoir évalué leur spécificité avec des souches pures, leur utilisation dans le sol rhizosphérique a permis, pour la première fois, de détecter in situ ces nouveaux groupes bactériens. Finalement, l’impact des métaux lourds sur la communauté bactérienne suivi d’une année de phytoextraction avec Thlaspi caerulescens a été examiné dans un sol artificiellement contaminé. Toutes les méthodes utilisées, électrophorèse sur gradient de dénaturant (DGGE), utilisation de 95 substrats pour la détermination du profil physiologique d’une communauté (CLPP) et mesure du potentiel d’oxydation de l’ammonium ont montré un effet drastique des métaux lourds sur la communauté microbienne. De plus, l’analyse des différents profils bactériens (Bacteria, β-Proteobacteria et bactéries responsables de l’oxydation de l’ammoniaque) obtenus par DGGE a permis de constater qu’une année de phytoremediation n’était pas suffisante pour permettre le rétablissement des populations initialement présentes dans le sol non contaminé. L’utilisation des 95 substrats a cependant permis d’observer un effet stimulant de la plante sur une partie de la communauté bactérienne qui s’est traduit par une augmentation du nombre de substrats métabolisés aussi bien dans le sol non contaminé que dans le sol contaminé. La qualité du sol a pu être évaluée en mesurant le potentiel d’oxydation de l’ammonium. Ce test a montré que les bactéries responsables de l’oxydation de l’ammoniaque n’étaient toujours pas fonctionnelles après une année de phytoremediation et que l’effet stimulant de la plante sur ces bactéries, clairement visible dans le sol non contaminé, n’était pas suffisant pour lever l’inhibition engendrée par les métaux lourds dans le sol contaminé. En conclusion, ce travail a démontré que l’utilisation de méthodes moléculaires combinée avec des techniques plus traditionnelles était très utile pour observer les changements induits par les métaux lourds au niveau de la structure et des fonctions de la communauté bactérienne. De plus, les techniques moléculaires ont permis d’identifier certaines populations qui pourraient s’avérer utiles pour la décontamination des sols pollués, offrant ainsi plusieurs perspectives de recherche pouvant déboucher sur le développement de nouvelles technologies.