Faculté des sciences de base SB, Section de chimie, Institut interfacultaire de Bioingénierie (SV/STI) IBI1 (Laboratoire de biotechnologie cellulaire (SV/STI) LBTC1)

Correlation between cell cycle and calcium phosphate transient transfection of CHO cells

Grosjean, Frédéric ; Wurm, Florian (Dir.)

Thèse sciences Ecole polytechnique fédérale de Lausanne EPFL : 2003 ; no 2829.

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    Summary
    Calcium phosphate transfection is a widely used method to produce recombinant proteins in mammalian cells. However, the mechanisms involved in plasmid DNA transfer to the nucleus of the transfected cells remain poorly understood and result in great variation of transfection efficiency. The role of the cell cycle in transfection by the calcium phosphate method was studied using Chinese Hamster Ovary (CHO) cells as a model system. Adherent cell cultures were synchronized at the G1/S boundary using mimosine. At various time points after the removal of the drug the cells were transfected with reporter plasmids that expressed either the enhanced green fluorescent protein (EGFP) or a red fluorescent protein (DsRedExpress). Fluorescent protein expression was monitored by fluorometry and live imaging. Cell cycle was monitored by flow cytometry. It was shown that the cell cycle had major implications on at least two levels. The correlation between the percentage of cells in S phase at the time of transfection complex addition and the resulting reporter gene expression demonstrated that efficient transfer of exogenous DNA in mammalian cells was dependent on the cell cycle. A faster transfection protocol, developed within this work, showed that the optimal timing for the transfection complex addition was different depending on the transfection set-ups used. Further investigations demonstrated that mitosis played a key role, probably due to the nuclear membrane disruption, to provide access to the nuclear environment for the plasmid DNA molecules. The glycerol shock performed at the end of the transfection was also shown to play an important role for efficient transfer of reporter gene in nuclei. This strong osmotic shock resulted in a cellular volume decrease of approximately 55%. As no intracellular plasmids were lost during the process, this resulted in a significant increase in intracellular plasmid concentration. Glycerol shock has to be performed while cells proceed through mitosis. The nuclear membrane disruption and the increasing intracellular plasmid concentration probably facilitate the access to the nuclear environment. The synergy of glycerol shock and cells proceeding through mitosis was a requirement for efficient reporter gene transfer in the nuclei. If one of those two was omitted, or if they did not happened at the same time, very low reporter gene expression levels were achieved. As it was found that plasmid DNA was driving reporter gene expression even after a delay of 45 minutes post cellular uptake, it was possible to efficiently target additional sub-populations of cells as they proceeded through mitosis with additional glycerol shocks. Those repetitive glycerol shocks resulted in an increase of positive cells among the transfected populations. In conclusion, the results obtained in this work permitted to define a model explaining the importance of the cell cycle in the calcium phosphate transfection, highlighting mitosis and glycerol shock as key events in plasmid DNA molecules transfer to the nucleus.
    Résumé
    La transfection par la méthode du calcium phosphate est une méthode largement utilisée pour produire des protéines recombinantes dans des cellules mammifères. Cependant, les mécanismes impliqués dans le transfert de l'ADN plasmidique dans le noyau des cellules transfectées sont encore mal compris et cela résulte en une grande variabilité de l'efficacité de transfection. Le rôle du cycle cellulaire dans la transfection par la méthode du calcium phosphate a donc été étudié en utilisant des cellules dérivées d'une lignée d'ovaire de hamster (CHO) comme modèle. Des cultures de cellules adhérentes ont été synchronisées à la frontière entre les phases G1 et S grâce à l'utilisation de la mimosine. Une fois la drogue de synchronisation retirée, les cellules ont été transfectées à différents moments suivant la réinitiation du cycle cellulaire avec des plasmides exprimant soit la protéine fluorescente verte (EGFP) soit une protéine fluorescente rouge (DsRedExpress). L'expression de ces protéines fluorescentes a été suivie par fluorométrie ou par imagerie en temps réel et le cycle cellulaire a été analysé par cytométrie en flux. Il a été montré que le cycle cellulaire a des implications majeures au moins à deux niveaux. La corrélation entre le pourcentage de cellules en phase S au moment de l'addition du complexe de transfection et l'expression de gène rapporteur résultante a démontré que le transfert efficace d'ADN exogène dans les cellules mammifères était dépendant du cycle cellulaire. Un protocole de transfection plus rapide, développé pendant ce travail, a montré que le moment optimal pour ajouter le complexe de transfection était dépendant du système de transfection utilisé. D'autres investigations ont démontré que la mitose jouait un rôle clé, sans doute dû à la rupture de la membrane nucléaire, pour fournir un accès aux molécules d'ADN plasmidique dans l'environnement nucléaire. Le choc glycérol réalisé à la fin de la transfection a montré qu'il jouait aussi un rôle important pour le transfert efficace de gène rapporteur dans les noyaux. Ce choc osmotique important résulte en une diminution du volume cellulaire d'environ 55%. Comme il n'y a pas de perte de plasmide intracellulaire pendant ce choc, cela résulte en une augmentation significative de leur concentration intracellulaire. Le choc glycérol doit être effectué pendant que les cellules progressent à travers la mitose, probablement car la désagrégation de la membrane nucléaire et l'augmentation de la concentration intracellulaire en plasmides facilitent l'accès à l'environnement nucléaire. La synergie entre le choc glycérol et les cellules progressant à travers la mitose était une nécessité pour un transfert efficace de gènes rapporteurs dans les noyaux. De très faibles niveaux d'expression de gènes rapporteurs ont été obtenus lorsque l'un ou l'autre de ces événements était omis ou s'ils ne se produisaient pas au même moment. Comme il a été montré que l'ADN plasmidique permettait une expression de gène rapporteur efficace même après un délai de 45 minutes suivant leur internalisation par les cellules, il a été possible de les transférer dans des sous-populations cellulaires additionnelles, lorsque cellesci passaient à travers la mitose, à l'aide de chocs glycérols supplémentaires. Ces chocs répétés ont résulté en une augmentation de cellules positives parmi les populations transfectées. En conclusion, les résultats obtenus pendant ce travail ont permis de définir un modèle expliquant l'importance du cycle cellulaire dans la transfection par la méthode du calcium phosphate, mettant en évidence la mitose et le choc glycérol comme des événements clé pour le transfert de molécules d'ADN plasmidique dans les noyaux.