Faculté des sciences de base SB, Section de chimie, Institut des sciences et ingénierie chimiques ISIC (Laboratoire d'électrochimie physique et analytique LEPA)

Polymer nanospray interfaces for on-line electrochemically induced modifications : application to protein mass spectrometry

Rohner, Tatiana ; Girault, Hubert (Dir.)

Thèse sciences Ecole polytechnique fédérale de Lausanne EPFL : 2003 ; no 2822.

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    Summary
    The aim of this work has been to design, and fabricate a miniaturized electrospray-type interface for mass spectrometry analysis, which allows the nebulization of solutions by applying a high potential difference between the source and the mass spectrometer. The fabrication of the nanospray emitter is based on UV-laser photoablation of polymer substrates. Thick-film channel flow electrodes can be integrated in the microfluidic system, allowing the application of a high voltage to generate electrospray from the open outlet of the microchannel. The polymer-based interface first presented is characterized by a flat edge interface. However, a V-shaped nozzle has been found to present higher stability and ease of use. This design also allows the generation of spray by applying high voltage through an electrode located in a solution reservoir, thereby inducing an electroosmotic pumping. Taking advantage of the intrinsic electrolytic behavior of electrospray, a specific electrochemically induced tagging of free cysteine residues located in proteins can be performed on-line. A p-hydroquinone buffer is used to perform a continuous infusion of protein solution. When in contact with the high-voltage microelectrode, p-hydroquinone undergoes oxidation, thereby producing protonated p-benzoquinone. The latter reacts with free cysteine residues, following a Michael-type addition. The modification of the protein can be followed thanks to MS analyses. A complete study of the mechanisms involved in the electrochemically induced tagging with hydroquinone has been carried out by cyclic voltammetry and digital simulation. The process of the tagging consists of an ECE mechanism, since the formed adduct is stabilized in the reduced state, and is thus free to be oxidized. The rate constant of the chemical reaction has been extracted, by performing cyclic voltammetry studies and modeling the whole system by digital simulations. Finite element simulations have also permitted to highlight several mechanistic aspects of the electrotagging. The nanospray interface has been modeled as a channel-flow electrode cell. After validation of the model with respect to the experimental results, kinetics and mass transport conditions have been investigated. The flow profile, as well as the kinetic rate constant, has been shown to be of great importance in the electrochemically induced tagging. The use of a sacrificial electrode as metallic ion source to generate electrospray has also been investigated. Transition metal electrodes, i.e. copper, zinc, nickel and iron, as well as silver, were used to get on-line complexation with model peptides. It has been demonstrated that the use of in-reservoir sacrificial electrode was an efficient method to generate metal ions in order to form complexes with peptides, without the addition of metallic salts. These studies have demonstrated that polymer nanospray interfaces can be advantageously used as analytical devices, together with their primary function, i.e. ionization sources for protein analyses by mass spectrometry.
    Résumé
    Ce travail de thèse est basé sur la conception et la fabrication d'une interface miniaturisée de type "électrospray", qui permet l'analyse de solutions par spectrométrie de masse en nébulisant la phase liquide grâce à l'application d'une très grande différence de potentiel entre la source et le spectromètre de masse. La source "nanospray" a été fabriquée grâce à la technique de photoablation par laser UV sur substrat polymère, qui permet de générer des microcanaux. De la même manière, des microélectrodes de carbone peuvent être intégrées au système microfluidique, permettant la génération de l'électrospray depuis la sortie du microcanal en y appliquant un très haut voltage. La première interface développée comporte un profil plat. Cependant, une interface présentant un profil en V a montré une utilisation plus aisée et une meilleure stabilité du point de vue de la détection. De plus, ce design permet d'utiliser le flux électroosmotique pour le pompage de la solution dans le canal, en appliquant le haut voltage à une électrode introduite dans un réservoir à solution. En exploitant le comportement électrolytique intrinsèque à l'électrospray, une modification spécifique aux cystéines libres contenues dans des protéines peut être obtenue en ligne, par l'infusion d'une solution contenant de l'hydroquinone et le matériel protéique d'intérêt. Lorsque la mixture passe au-dessus de la microélectrode, la p-hydroquinone s'oxyde, ce qui génère de la p-benzoquinone protonée. Cette dernière réagit avec les groupements thiols des cystéines, suivant un mécanisme d'addition de Michael. La modification en ligne de la protéine peut être suivie par spectrométrie de masse. Les mécanismes impliqués dans la modification électrochimiquement induite des cystéines ont été étudiés à l'aide de la voltamétrie cyclique et de simulations numériques. Le processus consiste en un mécanisme ECE, car l'adduit formé est stabilisé sous sa forme réduite et peut donc s'oxyder. En modélisant le système cystéine/p-hydroquinone, la constante de la réaction en phase homogène a pu être extraite des voltamogrames. Des simulations par éléments finis ont également permis de mettre en évidence différents aspects mécanistiques de la modification électrochimiquement induite. L'interface nanospray a été modélisée comme une électrode microbande en canal soumise à un flux laminaire. Après la validation du modèle par rapport aux résultats expérimentaux, l'importance de la cinétique de la réaction en phase homogène et du transport de masse a été étudiée. Il a été démontré que le profil du flux ainsi que la constante cinétique ont une grande influence sur l'efficacité de la modification. Finalement, l'utilisation d'électrodes sacrificielles pour l'électrospray comme sources d'ions métalliques a été étudié. Des électrodes de métaux de transition, tels que le cuivre, le zinc, le nickel, le fer, ainsi que l'argent, ont permis de générer en ligne des complexes metallopeptidiques. Il a été démontré que cette technique peut remplacer l'utilisation de sels métalliques pour l'étude de la formation et de la stabilité de ces complexes. Ces études montrent que les interfaces de type nanospray en polymère peuvent être avantageusement utilisées en tant qu'instruments analytiques, en plus de leur fonction de source d'ionisation pour des analyses de protéines/peptides par spectrométrie de masse.