Faculté des sciences

Intracellular vesicle transport in "Arabidopsis thaliana" : functional characterization of the t-SNARE homologue AtSNAP33

Wick, Peter ; Sticher, Liliane (Dir.)

Thèse de doctorat : Université de Fribourg, 2002 ; no 1386.

The secretory pathway is a complex endomembrane system essential for all eukaryotic cells. It transports proteins to the extracellular space or to the vacuole. All proteins which are secreted are synthesized at the endoplasmic reticulum (ER) and have a signal peptide in common. The signal peptide is necessary for the transport into the lumen of the ER where the correct folding of the protein... Plus

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    Zusammenfassung
    Alle eukaryontischen Zellen benötigen für die Sekretion ein funktionierendes endomembranes System. Proteine, die sekretiert werden besitzen ein Signalpeptid und werden am Endoplasmatischen Retikulum (ER) synthetisiert. Das Signalpeptid initiiert den Transport in den Lumen des ER und wird danach enzymatisch vom Protein abgetrennt. Korrekt gefaltete Proteine werden in Vesikel gepackt, die sich vom ER abschnüren und mit der cis Seite des Golgi Apparats fusionieren. Die Proteine durchlaufen den Golgi Apparat und an der trans Seite des Golgis werden die Proteine, die für die Prevakuole, lytische Vakuole oder Proteinvakuole bestimmt sind getrennt von den Proteinen, die ihre Funktion im interzelluläre Raum haben. Der Transport zwischen den einzelnen Organellen, die in der Sekretion involviert sind, findet via Vesikel statt, die sich von einer Geber-Membran abschnüren und mit der entsprechenden Ziel-Membrane fusionieren. Die korrekte Fusion der einzelnen Vesikel mit der entsprechenden Organelle ist von höchster Wichtigkeit, ansonsten verliert die Zelle ihre Kompartimentierung und kollabiert. Verschiedene SNARE-Proteine (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor adaptor proteins receptors) und die entsprechenden Faktoren sind verantwortlich für die einzelnen Fusionen von Vesikeln mit den entsprechenden Membranen. Das allgemein akzeptierte Modell postuliert, dass ein Membran assoziertes Protein auf dem Vesikel (v-SNARE) mit einem Membran assozierten Protein auf der entsprechenden Organelle (t-SNARE) wie Schlüssel und Schloss interagieren. SNARE Proteine sind detailliert beschrieben in Nervenzellen. Die Neurotransmitter werden via Vesikelfusion mit der Plasmamembran, beim Eintreffen eines Aktionspotential ausgeschüttet. In diesem Fall interagiert das Synaptobrevin, ein v- SNARE welches auf dem Vesikel lokalisiert ist, mit zwei t-SNAREs SNAP-25 und Syntaxin 1A, beide mit der Plasmamembran verbunden, zu einem ungewöhnlich stabilen SNARE-Komplex. NSF und α-SNAP, zwei SNARE bindende Faktoren sind in der Lange unter Hydrolyse von ATP den Komplex aufzulösen. In dieser Arbeit wurde ein Arabidopsis Homolog von dem t-SNARE SNAP-25, AtSNAP33 isoliert. AtSNAP33 interagiert mit KNOLLE, ein Zytokinese spezifisches Syntaxin, welches an der Plasmamembran lokalisiert ist und essentiell für die korrekte Bildung der neuen Zellmembran während der Zytokinese ist. AtSNAP33 ist ein allgegenwärtig exprimiertes Membranprotein. Pflanzen reagieren nach Befall von Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Viren mit der Produktion von Abwehrproteinen (Pathogenesis related) PR Proteinen. Einige von den PRs werden am ER synthetisiert und in den interzellularen Raum sekretiert. Infizierte, wie auch mechanisch beanspruchte Blätter von Arabidopsis haben eine erhöhte Menge von AtSNAP33 im Vergleich zu nicht behandelten Blätter. Eine T-DNA Insertion im AtSNAP33 Gen, welches den Verlust von AtSNAP33 bedeutet, resultiert in einem letalen Zwerg-Phänotyp der Pflanze. Sieben Tage nach der Keimung kann die Bildung von ROI (reactive oxygen intermediates) und Nekrosenbildung auf den Kotyledonen beobachtet werden. Die Nekrosen breiten sich auf die ganze Pflanze aus und nach 3 bis 4 Wochen stirbt die atsnap33 Mutante. Das Wurzelwachstum der Mutante ist reduziert verglichen mit dem Wildtyp, welche unter den gleichen Bedingungen gewachsen sind. In sieben Tag alten atsnap33 Mutanten sind die Abwehrgene PR-1, PR-2 und PDF1.2 exprimiert im Gegensatz zu den beiden Homologen von AtSNAP33, AtSNAP29 und AtSNAP30, welche nicht exprimiert sind. Atsnap33 Mutanten wurden mit einer Gerste α- Amylase, welche konstitutiv sekretiert wird, transformiert. In den ersten sieben Tagen war kein Unterschied zwischen der Mutante und Columbia die je mit der gleichen α-Amylase transformiert wurde, festzustellen. Aber in den folgenden Tagen wurde die α-Amylase Sekretion in der atsnap33 Mutante inhibiert. Diese Inhibition korreliert mit der Bildung der Nekrosen. Die Reduktion des Wurzelwachstums und der Inhibierung der α-Amylase Sekretion in der atsnap33 Mutante zeigt, dass AtSNAP33 für eine funktionelle Sekretion nötig ist. Mit Hilfe eines 'Yeast two hybrid Screen’ mit AtSNAP33 als Köder, führte zur Isolation von zwei noch nicht beschriebenen Syntaxinen (t-SNARE) AtSYP122 und AtSYP43. AtSYP122 ist konstitutiv in den Wurzeln exprimiert, nicht aber in Stengeln, Blätter, Blüten oder Schoten. Die Transkription von AtSYP122 wurde durch Inokulation von Krankheitserregern induziert. AtSYP43 ist weder in Wurzeln, Blätter, Stengeln, Blüten noch in den Schoten exprimiert. Auch das Inokulation von Krankheitserregern in die Blätter stimuliert nicht die Transkription von AtSYP43. Interessanterweise sind AtSYP122 und AtSYP43 in der atsnap33 Mutante exprimiert, welche keine Expression von AtSNAP33 zeigt. Die biologische Funktion und Lokalisation von AtSYP122 und AtSYP43 sind nicht bekannt.
    Summary
    The secretory pathway is a complex endomembrane system essential for all eukaryotic cells. It transports proteins to the extracellular space or to the vacuole. All proteins which are secreted are synthesized at the endoplasmic reticulum (ER) and have a signal peptide in common. The signal peptide is necessary for the transport into the lumen of the ER where the correct folding of the protein takes place. Then proteins are packaged into vesicles which bud of from the ER and transported to the cis-Golgi and fuse with it. The proteins go through the Golgi apparatus and at the trans Golgi network (TGN) they are sorted into vesicles destined for several organelles including the prevacuolar compartment (PVC), lytic vacuole, protein storage vacuole, (PSV) or for secretion to the plasma membrane (PM). Transport between the organelles of the secretory pathway occurs by budding of vesicles from a donor membrane and fusion with an acceptor membrane. The fusion of the appropriate vesicles with the correct target membrane is of outmost importance, otherwise the cell will lose its compartmentalisation and collapse. Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor adaptor proteins receptors (SNAREs) and their associated factors were described to be responsible for these fusions steps. The general hypothesis postulates that a membrane associated protein on the vesicle, the v-SNARE, interacts with another membrane associated protein on the target membrane, the t-SNARE. SNAREs are well studied in neuronal cells where vesicles fuse with the plasma membrane to release neurotransmitters after an action potential. In this case the v-SNARE synaptobrevin which is located on the vesicle interacts with the two t-SNAREs SNAP-25 and syntaxin1A at the plasma membrane and form a SNARE core complex which is unusual stable. NSF and α-SNAP two SNARE binding proteins are able to disassociate the complex by hydrolysis of ATP. In this work an Arabidopsis homologue of the t-SNARE SNAP-25, AtSNAP33 was identified as an interactor of KNOLLE. KNOLLE is a cytokinesis-specific syntaxin which is localized at the phragmoplast and is needed for proper cell plate formation during cytokinesis. AtSNAP33 is an ubiquitously expressed membrane-associated protein. Plants respond to bacterial, fungal and viral pathogen attack by the synthesis of several pathogenesis related (PR) proteins. Some of these PR’s are synthesized at the ER and transported to the extracellular space by the secretory pathway. AtSNAP33 is induced in infected leaves as well after mechanical stimulation such as touch and wind and wounding. A T-DNA insertion in the AtSNAP33 gene caused loss of AtSNAP33 function, resulting in a lethal dwarf phenotype. Seven days after germination reactive oxygen intermediates (ROI) and lesion formation can be observed on the cotyledons. The lesions spreads out over the whole plant expect the roots and after 3 - 4 weeks the upper green part of the plant is dead. The root growth rate in the mutants was lower compared to the wild type which were grown in the same conditions. In 7 day old atsnap33 mutants the defence genes PR-1, PR-2, and PDF1.2 were upregulated whereas the two homologues of AtSNAP33, AtSNAP30 and AtSNAP29 were not expressed. Atsnap33 mutants and Columbia plants as a control were transformed with a barley α-amylase which is constitutively expressed and secreted. In the first 7 days there was no difference in secretion of α-amylase and the mutant expressing α-amylase. But after 7 days the secretion of α-amylase was inhibited in the atsnap33 mutant. This correlates exactly with the development of the lesion mimic phenotype. The reduction of the root growth together with inhibited secretion of α- amylase indicate that AtSNAP33 is necessary for successful secretion of proteins. A yeast two hybrid screen with AtSNAP33 as a bait, led to the isolation of two not yet described syntaxins (t-SNARE) AtSYP122 and AtSYP43. AtSYP122 is constitutively expressed in roots but not in inflorescence stems, leaves, flowers and siliques. However AtSyp122 transcripts were induced in leaves after inoculation with pathogens. AtSyp43 transcripts were not expressed in roots, inflorescence stems, leaves, flowers and siliques as analysed by RNA blot hybridisation. Neither pathogen inoculation nor mechanical stimulation led to the induction of the expression of AtSyp43. Interestingly, the AtSyp122 and AtSyp43 transcripts were highly expressed in atsnap33 plants which show no expression of AtSNAP33. The biological function and localization of AtSYP122 and AtSYP43 are still unknown.