Faculté des sciences

Glycosylphosphatidylinositol membrane anchors in "Saccharomyces cerevisiae" : characterization of proteins involved in side chain modifications

Flury, Isabelle ; Conzelmann, Andreas (Dir.) ; Aebi, Markus (Codir.) ; Puoti, Alessandro (Codir.)

Thèse de doctorat : Université de Fribourg, 2001 ; Nr. 1361.

In eukaryotic cells, a subset of proteins is attached to the outer leaflet of the plasma membrane by a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor. Apart from providing stable membrane anchorage, GPI anchors are thought to be associated with other functions, such as signal transduction and protein targeting. The biosynthesis of the GPI anchor and its transfer to proteins is highly conserved in... Plus

Ajouter à la liste personnelle
    Zusammenfassung
    Die Verankerung von bestimmten Proteinen an der Aussenseite der Plasmamembran mittels eines Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-Ankers ist in eukaryontischen Zellen weit verbreitet. Es gibt Hinweise, dass GPI-Anker neben ihrer Funktion als stabiler Anker auch eine wichtige Rolle in der Uebertragung von Signalen und in der Sortierung von Proteinen spielen. Sowohl die Biosynthese des GPI-Ankers als auch seine Anheftung an Proteine sind konservierte Prozesse. Das Grundgerüst aller GPI-Anker, (EthN-P)-6Man α 1-2Man α 1-6Man α 1-4GlcN α 1-6 myo-inositol-PO4-lipid, wird durch schrittweise Addition von Zuckern und Ethanolaminphosphat an das Lipid Phosphatidylinositol, aufgebaut. Diese konservierte Grundstruktur der GPI-Anker ist in verschiedenen Organismen mit verschiedenen Seitenketten dekoriert. Dass GPI-Anker in Säugerzellen EthN-P-Seitenketten haben, ist schon seit mehreren Jahren bekannt. In der Hefe hingegen wurden EthN-P-Seitenketten erst kürzlich entdeckt. Mehrere Gene, die in der Biosynthese von GPI-Ankern eine Rolle spielen, wurden durch Komplementierung von GPI-defizienten Hefe- und Säugetierzellen kloniert. Viele zelluläre Prozesse sind sehr ähnlich in der Hefe Saccharomyces cerevisiae und in höheren Zellen. Weil Hefe für genetische Studien sehr geeingnet ist, erforschen wir die GPI-Biosynthese in diesem Modellorganismus. Auf dem hydrophilsten GPI-Vorläufer in gpi7 Mutanten fehlte eine Seitenkette mit Phosphodiester-Bindung auf Man2 im Vergleich zum kompletten GPI Vorläufer CP2, was vermuten liess, dass das zugehörige Enzym Gpi7p nötig ist zum Anhängen einer Seitenkette an die zweite Mannose. Daher war es verlockend zu spekulieren, dass YLL031c/GPI13 und MCD4, Gene mit grosser Sequenzhomologie zu GPI7, eine Rolle spielen in der Anheftung von Seitenketten an die erste und dritte Mannose von GPI-Ankern. Das Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung von Proteinen, die für das Anheften von Seitenketten an Hefe-GPIAnker nötig sind. Eine Verringerung der Menge des Proteins Gpi13p verursachte eine geschwächte Zellwand und eine Verminderung der Menge GPI-verankerter Proteine. Weiter führete die Verringerung von Gpi13p in vivo zur Akkumulierung eines GPI-Glycolipids, dem die EthN-PSeitenkette auf der dritten Mannose fehlte, was darauf deutete, dass Gpi13p nötig ist für den Transfer von EthN-P auf Man3. Ein Glycolipid mit der gleichen Mobilität akkumulierte auch in in vitro-Experimenten mit Microsomen. Mutation oder Verringerung der Proteins Mcd4p verursachte die Akkumulierung von GPI-Vorläufern, denen EthN-P auf der ersten Mannose fehlte. Diese Resultate sind in Einklang mit der Idee, dass Gpi13p EthN-P auf die innere α1-2-gebundene Mannose, und Mcd4p EthN-P auf die α1-4-gebundene Mannose überträgt. Wir konnten zeigen, dass eine etikettierte Form von Gpi13p im Endoplasmatischen Reticulum (ER) lokalisiert ist. Im Gegensatz dazu war der grösste Teil des Proteins Gpi7p auf der Zelloberfläche lokalisiert. Eine Reduzierung der Menge von Gpi13p oder Mcd4p in Hefezellen führte zur Aktivierung einer Signalkaskade als Antwort auf Stress im ER, was ein weiterer Hinweis darauf ist, dass GPI-Verankerung von Proteinen für Saccharomyces cerevisiae ein lebenswichtiger Prozess ist.
    Summary
    In eukaryotic cells, a subset of proteins is attached to the outer leaflet of the plasma membrane by a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor. Apart from providing stable membrane anchorage, GPI anchors are thought to be associated with other functions, such as signal transduction and protein targeting. The biosynthesis of the GPI anchor and its transfer to proteins is highly conserved in eukaryotes. The common GPI backbone, (EthNP)- 6Man α1-2Man α 1-6Man α 1-4GlcN α 1-6 myo-inositol-PO4-lipid, is assembled by the sequential additions of sugar and ethanolaminephosphate to phosphatidylinositol. The conserved GPI core is modified by various side chains in different organisms. Side chain modification of mannoses with EthN-P has been described in mammalian cells and recently also in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Several genes involved in GPI biosynthesis have been cloned by complementation of GPI-deficient yeast and mammalian mutants. We have studied GPI anchoring in Saccharomyces cerevisiae, because this organism is amenable to genetic studies and has advantages such as relevance to higher systems. In comparison to the complete GPI precursor glycolipid CP2, the most polar GPI accumulating in yeast gpi7 mutants lacked a HF-sensitive side chain on Man2, suggesting that the corresponding protein, Gpi7p, might be involved in the addition of a side chain to the second mannose of the GPI core. It was therefore tempting to speculate that the proteins encoded by the two yeast homologues of GPI7, YLL031c/GPI13 and MCD4, might play a role in the transfer of EthN-P to the first and third mannose of the GPI core. This study had as major objective the characterization of the enzymes involved in EthN-P transfer to the GPI precursor in Saccharomyces cerevisiae. Depletion of GPI13 resulted in cell wall fragility, and a reduction of GPI anchor addition to proteins. The most polar GPI glycolipid that accumulated in vivo in cells depleted of Gpi13p lacked the bridging EthN-P on Man3 of the GPI core, suggesting that Gpi13p is involved in the transfer of EthN-P to Man3. A glycolipid with the same mobility also accumulated in in vitro experiments with microsomes from Gpi13p-depleted cells. Similarly, mutation or depletion of Mcd4p resulted in accumulation of GPI intermediates lacking EthN-P on Man1. These results are compatible with the idea that Gpi13p transfers EthN-P to the inner α1-2-linked mannose, and that Mcd4p transfers EtN-P onto the α1-4-linked mannose of the GPI core. A tagged form of Gpi13p was shown to be localized in the ER. In contrast, the bulk of Gpi7p was localized on the cell surface. Depletion of Gpi13p or Mcd4p induced a stress response known as the Unfolded Protein Response, providing further evidence that GPI anchoring is an essential process in Saccharomyces cerevisiae.