Faculté des sciences

Pyrrolizidine alkaloids : occurrence in bee products and impact on Honeybees ("Apis mellifera" L.)

Lucchetti, Matteo Angelo ; Turlings, Ted (Dir.)

Thèse de doctorat : Université de Neuchâtel, 2017.

Les alcaloïdes pyrrolizidiniques (AP) sont des métabolites secondaires toxiques formés par une grande variété de plantes, notamment par celles de la famille des boraginacées, des astéracées et des fabacées, pour se défendre contre les herbivores. La consommation de produits contaminés par des AP peut avoir des effets tératogènes, génotoxiques, cancérigènes et hépatoxiques sur les... Plus

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    Résumé
    Les alcaloïdes pyrrolizidiniques (AP) sont des métabolites secondaires toxiques formés par une grande variété de plantes, notamment par celles de la famille des boraginacées, des astéracées et des fabacées, pour se défendre contre les herbivores. La consommation de produits contaminés par des AP peut avoir des effets tératogènes, génotoxiques, cancérigènes et hépatoxiques sur les animaux et les humains. Les AP se trouvent principalement dans les feuilles, les racines et les semences et sont susceptibles d’entrer directement dans la chaîne alimentaire par le biais des aliments d’origine végétale, comme les thés ou les céréales, ou indirectement par la contamination du fourrage destiné au bétail. Quelquefois, les AP peuvent également se trouver dans le miel ou le pollen lorsque les abeilles recueillent le nectar et le pollen des plantes produisant des AP. La teneur en AP est parfois plus élevée dans le pollen que dans les feuilles des plantes. Par contre, on sait encore peu de choses sur la teneur en AP du nectar des plantes. La présence d’AP dans les produits d’origine florale soulève deux questions majeures. Premièrement: le nectar ou le pollen sont-ils la principale source responsable de la contamination du miel par les AP? Deuxièmement: quel est l’impact de ces composés toxiques secondaires sur les colonies d’abeilles? La présente thèse a pour but d’examiner ces deux questions en utilisant l’abeille mellifère européenne Apis mellifera L. et la vipérine commune Echium vulgare L. comme système-modèle. E. vulgare est une plante européenne commune produisant une grosse quantité de pollen et de nectar et qui constitue une importante ressource pour différentes espèces d’abeilles.
    Les recherches relatives à l’impact des AP sur les abeilles mellifères et les produits à base de miel représentent un domaine ambitieux. Les AP sont une catégorie de toxines difficile à étudier étant donné la grande diversité taxonomique des plantes produisant des AP, les nombreux isomères d’AP connus, le manque de matériel de référence approprié et l’absence de méthodes d’analyse standard fiables. C’est pourquoi la recherche suppose au préalable l’extraction, l’isolement et la purification d’AP issus de plantes, non disponibles dans le commerce.
    Les abeilles mellifères forment de larges colonies eusociales qui dépendent du pollen et du nectar stockés dans la ruche comme réserve alimentaire. Les ouvrières recueillent de grandes quantités de ces ressources florales, mélangeant souvent de nombreuses sources botaniques, parmi elles E. vulgare. Le pollen est stocké dans la ruche sous la forme d’un pain d’abeille, tandis que le miel est obtenu à partir de la concentration du nectar et ne contient que quelques traces de pollen. Les abeilles mellifères adultes se nourrissent de ces deux produits qui sont les principales sources de protéines (pain d’abeille) et d’hydrates de carbone (miel) de l’ensemble de la colonie. Contrairement aux autres abeilles, les larves de l’abeille mellifère ne se nourrissent pas de pollen et de nectar au début de leur développement: elles sont nourries progressivement par les abeilles nourricières, qui consomment de larges quantités de pain d’abeille et produisent des sécrétions riches en protéines à l’aide de glandes spécifiques: les glandes hypopharyngiennes et mandibulaires. Le pollen est la principale source de protéines et les composés secondaires du pollen, tels que les AP, peuvent représenter un risque potentiel pour les larves lorsque des plantes produisant des AP sont présentes à proximité de la ruche. C’est pourquoi l’étude du parcours suivi par les composés secondaires du pollen et du nectar jusque dans la ruche est complexe et suppose des analyses de pollen, de nectar, de pain d’abeille, de miel et idéalement des sécrétions hypopharyngiennes.
    La thèse de doctorat présentée ici étudie pour la première fois de manière approfondie la voie de contamination par les AP depuis les plantes jusqu’au miel de même que l’impact des AP contenus dans le pollen sur les abeilles mellifères et leurs larves. La thèse est divisée en trois chapitres:
    Dans le chapitre 1, nous avons développé un protocole pour faciliter la collecte, l’extraction et le profilage LC-MS des AP contenus dans le pollen d’E. vulgare et d’Eupatorium cannabinum, deux plantes majeures productrices d’AP en Suisse. Nous proposons également une méthode permettant d’extraire et d’isoler de grandes quantités d’AP provenant d’E. vulgare afin d’obtenir de l’échimidine et de l’échivulgarine pures pour les tests biologiques.
    Dans le chapitre 2, nous examinons la voie d’entrée des AP issus d’Echium dans le miel. Les espèces d’Echium sont suspectées d’être à la base des fortes concentrations d’AP que l’on trouve parfois dans le miel européen, puisque les miels contenant des AP présentent souvent des traces de pollen d’Echium. Sachant que le pollen d’Echium contient des concentrations particulièrement élevées d’AP, l’hypothèse actuelle est qu’il est la principale source de contamination du miel par ce métabolite. Par conséquent, il a été suggéré de filtrer le miel pour réduire les teneurs en AP dans les miels provenant d’Echium. Nous avons comparé les profils AP du nectar de fleurs et du pollen des plantes d’E. vulgare aux profils AP du miel produit dans des ruchers situés à proximité de plantes d’E. vulgare. Nos résultats indiquent que le nectar est probablement le contribuant principal de la teneur du miel en AP et non pas le pollen, comme supposé jusqu’à aujourd’hui. Ces découvertes ont des implications importantes pour les pratiques apicoles et permettent d’établir des directives afin de minimiser la concentration en AP des miels.
    Dans le chapitre 3, nous étudions de manière approfondie les effets des AP contenus dans le pollen sur le développement des colonies d’abeilles mellifères en effectuant des tests toxicologiques alimentaires avec des AP sur les abeilles mellifères adultes (Apis mellifera) et sur leurs larves. Selon les résultats obtenus, les AP d’Echium sont toxiques pour les larves en faibles concentrations. Il est ainsi démontré pour la première fois que les composés secondaires trouvés dans le pollen sont susceptibles d’influencer considérablement le développement des abeilles. Le contraste est d’autant plus frappant que les AP en concentrations nettement plus élevées, proches des concentrations réelles, étaient tolérées par les abeilles adultes. Toutefois, sachant que le pollen est la seule source de protéines des abeilles nourricières, il suffit qu’une fraction d’AP passe du pain d’abeille dans les sécrétions nourricières destinées à l’alimentation des larves pour que les AP du pollen aient un impact sur le développement de la colonie. Afin d’étudier cette question, nous avons développé une nouvelle méthode dans laquelle les abeilles mellifères nourricières étaient obligées de se nourrir de pain d’abeille dont la teneur en AP était connue. Les sécrétions hypopharyngiennes produites par ces abeilles étaient ensuite recueillies et analysées. Seules des traces d’AP ont été trouvées dans ces sécrétions, ce qui est surprenant et prouve que l’acte nourricier agit comme un filtre pour certaines toxines dans les colonies d’abeilles mellifères. Ces résultats ont des implications majeures. Premièrement, l’abeille mellifère est l’espèce d’abeille le plus généraliste que l’on connaisse. Comment ce large spectre de pollen est-il possible étant donné la complexité et la diversité chimiques du pollen ? C’est une question qui reste en suspens. Nos résultats suggèrent que l’alimentation des larves réduit les contraintes physiologiques associées à la digestion du pollen. Deuxièmement, différents produits chimiques, tels que les pesticides sont susceptibles de suivre le même chemin en passant du pollen et du nectar à la ruche. Actuellement, aucune étude n’a été faite pour savoir si les pesticides passaient dans le régime alimentaire des larves; notre système expérimental pourrait servir à étudier cette question importante.
    En conclusion, cette thèse apporte des réponses cruciales. Premièrement, en dépit de sa faible teneur en AP, il s’est avéré que le nectar des plantes était le vecteur majeur des AP dans le miel, contrairement à l’hypothèse actuelle qui veut que le pollen des plantes soit le contribuant essentiel des AP dans le miel. Deuxièmement, nous avons trouvé une nouvelle caractéristique dérivée du comportement eusocial des abeilles mellifères. En effet, nous avons découvert que les soins parentaux jouaient un rôle clé dans la protection des générations futures contre les métabolites secondaires des plantes et que par conséquent, ils augmentaient les chances de survie de la colonie.
    La thèse est le résultat de la collaboration entre l’Unine et Agroscope. Tous les essais biologiques ont été réalisés au centre de recherche apicole d’Agroscope (Liebefeld), l’extraction et l’analyse des AP ont été effectuées à l’Unine (Neuchâtel).
    Summary
    Pyrrolizidine alkaloids (PAs) are toxic plant secondary metabolites produced as defense against herbivores by a wide variety of plants, mainly of the Boraginaceae, Asteraceae and Fabaceae families. Consumption of products contaminated with PAs may lead to hepatotoxic, carcinogenic, genotoxic and teratogenic effects in animals and humans. PAs are mostly found in leaves, roots and seeds, and may directly enter the food chain via plant-derived food, such as teas or grains, or indirectly through the contamination of livestock fodder. Occasionally however, PAs are also found in honey or bee pollen when bees collect nectar and pollen from PA-producing plants. In plant pollen, the PA content is in some cases higher than the one in leaves, while little is known about the PA content of plant nectar. The presence of PAs in floral rewards raises two important questions. First, is nectar or pollen the main source responsible for PA contamination of honey? Second, what is the impact of these toxic secondary compounds on bee colonies? The aim of the present thesis is to examine these two questions using the European honeybee Apis mellifera L. and the viper bugloss Echium vulgare L. as a model system. E. vulgare is a common European plant producing copious pollen and nectar and it is an important resource for various bee species.
    Research on the impact of PAs on honeybees and on bee products is a challenging field of research. PAs are a difficult class of toxins to investigate due to the large taxonomic diversity of PA-producing plants, the numerous known PA isomers, the lack of adequate reference material, and the absence of reliable standardized analytical methods. Therefore the extraction, isolation and purification of non-commercially available PAs from plants are research prerequisites.
    Honeybees build large eusocial colonies relying on pollen and nectar, stored in the hive as food source. Workers collect large quantities of these floral resources, often mixing numerous botanical sources, including E. vulgare. Pollen is stored in the hive as "bee bread", while honey is obtained from the concentration of nectar and contains only traces of pollen. Adult honeybees feed on these two products, which are the main sources of protein (bee bread) and carbohydrates (honey) for the entire colony. Unlike other bees however, honeybee larvae do not primarily feed on pollen and nectar: they are progressively fed by nursing bees, which consume large quantities of bee bread and produce protein-rich secretions with specific glands: the hypopharyngeal and mandibular glands. Indirectly, pollen is still the main source of protein for larvae and pollen secondary compounds, such as PAs, may potentially pose a risk for larvae when PA-producing plants are present near the hive. Therefore, examining the pathway of pollen and nectar secondary compounds in the hive is complex and implies analyses of pollen, nectar, bee bread, honey and, ideally, hypopharyngeal secretions.
    The following doctoral thesis comprehensively investigates for the first time the route of the PA contamination from the plants to the honey, and the impact of pollen PAs on honeybees and honeybee larvae. It is divided into the following three chapters:
    In chapter 1, we develop a protocol to facilitate the collection, extraction and LC-MS profiling of PAs from plant pollen from E. vulgare and Eupatorium cannabinum, two main PA-producing plants found in Switzerland. We also propose a method for extracting and isolating of large quantities of PAs from E. vulgare to obtain pure echimidine and echivulgarine for bioassays.
    In chapter 2, we track the entry pathway of Echium PAs into honey. Echium species are suspected to underlie the high PA concentrations sometimes found in European honey, since these PA-containing honeys often contain trace amounts of Echium pollen. Since Echium pollen contains particularly high concentrations of PAs, it is currently assumed that Echium pollen is the main source of PA contamination in honey. Consequently, honey filtration has been suggested as a measure to reduce PA levels in honeys derived from Echium. We compare the PA profiles of floral nectar and plant pollen of E. vulgare with the PA profile of honey produced at apiaries placed in the vicinity of E. vulgare plants. Our results strongly indicate that nectar is likely the main contributor to the PA content of honey, and not pollen as currently assumed. These findings have important implications for beekeeping practices and enable the formulation of guidelines to minimize PA levels in honeys.
    In chapter 3, we comprehensively examine the effects of pollen PAs on the development of honeybee colonies by performing toxicological feeding assays with PAs on adult honeybees (Apis mellifera) and honeybee larvae. Our results show that Echium PAs are toxic to larvae at low concentrations, demonstrating for the first time that secondary compounds found in pollen have the potential to strongly impact bee development. In striking contrast, PAs at much higher, near realistic concentrations were tolerated by adult bees. However, since pollen is the exclusive source of protein for nursing bees, pollen PAs may still impact colony development if only a fraction of the PAs pass from the bee bread into the nursing secretions fed to larvae. To investigate this question we established a new method in which nursing honeybees were forced to feed on bee bread supplemented with known levels of PAs. Hypopharyngeal secretions produced by these bees were collected and analyzed. Surprisingly, only trace amounts of PAs were found in these secretions, demonstrating that nursing acts as a filter for some toxins in honeybee colonies. These results have two important implications. First, the honeybee is the most generalist bee species known. How this wide pollen spectrum is possible given the complex and diverse pollen chemistry has remained an unanswered question. Our results suggest that larval nursing relaxes the physiological constraints associated with pollen digestion. Second, various chemicals, such as pesticides, are likely to follow the same pathway from pollen and nectar into the hive. Whether pesticides pass into the larval diet has not been investigated so far; our experimental system may be used to examine this important question.
    In conclusion, this thesis brings two important answers. Firstly, despite its low PA content, plant nectar was found as the major vehicle of PAs into honeys, in contrast to the current hypothesis suggesting plant pollen as the major contributor of PA in honey. Secondly, we discovered a new feature deriving from the honeybee’s eusocial behaviour. In fact, parental caring was found to play a key role for the protection of the future generations against plant secondary metabolites and therefore increase the chances of survival of the colony.
    The thesis is the result of a collaboration between Unine and Agroscope. All bioassays were performed at the Agroscope Bee Research centre (Liebefeld), extraction and analytics of PAs were performed at Unine (Neuchâtel).