Faculté des sciences

Evaluation of acaricide resistance in the cattle tick, 'Rhipicephalus (Boophilus) microplus', using a new in vitro test and molecular tools

Lovis, Leonore ; Betschart, Bruno (Dir.) ; Sager, Heinz (Codir.)

Thèse de doctorat : Université de Neuchâtel, 2012.

Rhipicephalus (Boophilus) microplus est une tique des bovins à un hôte qui se trouve dans les zones tropicales et subtropicales. Cet ectoparasite a un impact économique très important sur l’élevage bovin dans toutes les régions où il se trouve. Au Brésil, par exemple, les pertes dues à son impact direct et indirect ont été estimées à 2 milliards de dollars US en 2000. Le... Plus

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    Résumé
    Rhipicephalus (Boophilus) microplus est une tique des bovins à un hôte qui se trouve dans les zones tropicales et subtropicales. Cet ectoparasite a un impact économique très important sur l’élevage bovin dans toutes les régions où il se trouve. Au Brésil, par exemple, les pertes dues à son impact direct et indirect ont été estimées à 2 milliards de dollars US en 2000. Le contrôle des populations de tiques des bovins repose essentiellement sur l’utilisation d’acaricides. L’utilisation intensive de ce moyen de lutte a eu pour conséquence le développement de résistances à la majorité des classes d’acaricides disponibles sur le marché. Un suivi local de la résistance aux acaricides est essentiel afin que les éleveurs puissent recevoir des informations sur les composés auxquels les populations de tiques présentes dans leur établissement sont résistantes et être guidés dans le choix de composés de remplacement à disposition. A une échelle globale, le suivi de la résistance permet d’observer sa progression afin d’essayer de ralentir son développement et d’allonger la durée d’utilisation des composés.
    Les tests in vitro sont des méthodes très utiles pour détecter la résistance des tiques. La FAO recommande deux d’entre eux, l’un utilisant des larves, nommé Larval Packet test (LPT), l’autre utilisant des adultes, appelé Adult Immersion Test (AIT). Chaque test a ses avantages et ses inconvénients : le LPT est un test laborieux qui prend beaucoup de temps alors que le AIT nécessite une grande quantité de tiques. Ces désavantages limitent le nombre de composés et de doses pouvant être testés, limitant ainsi l’information obtenue. Pour surmonter ces difficultés, nous avons développé un nouveau test, nommé Larval Tarsal Test (LTT), qui permet de tester de nombreux composés en peu de temps et avec un minimum de tiques. Dans ce test, des œufs de tiques sont distribués dans des puits de plaques de microtritation préalablement traités avec les acaricides voulant être testés. Les œufs sont incubés jusqu’à l’éclosion des larves, qui sont ainsi exposées aux composés. La résistance des souches de tiques est alors évaluée en fonction de la mortalité des larves écloses. La capacité du LTT à détecter la résistance a été comparée au LPT, un des tests recommandés par la FAO. Pour cela, une souche de tiques sensible ainsi qu’une souche résistante de référence ont été exposées à neuf composés de cinq classes principales d’acaricides : les organophosphorés (OP), les pyréthroïdes de synthèse (SP), les amidines, les lactones macrocycliques (ML) et les phénylpyrazoles. Le LTT a permis d’obtenir de bonnes courbes de dose-réponse, il s’est montré aussi sensible que le LPT et, à mortalités équivalentes, a nécessité des doses de composés nettement plus basses que le LPT.
    Ayant démontré que le LTT est un test adéquat, des populations de tiques provenant d’Argentine, d’Afrique du Sud et d’Australie ont été envoyées en Suisse pour évaluer leur résistance à l’aide du LTT. Ces tests ont confirmé l’intérêt du LTT à être utilisé pour détecter la résistance dans des populations provenant du terrain. Afin que ce test puisse être effectué dans d’autres laboratoires, le LTT a été modifié de sorte que l’infrastructure nécessaire à sa réalisation soit simple. Suite à cela, le LTT a été utilisé dans deux laboratoires brésiliens, pour tester des populations de tiques locales. Quelques-unes de ces populations ont aussi été testées avec le LPT pour permettre des comparaisons supplémentaires. A nouveau, le LTT s’est monté très efficace en termes de temps et adéquat pour détecter la résistance aux acaricides des populations de terrain avec, cette fois-ci, une sensibilité même plus élevée que le LPT. Ces études ont également permis de fournir des données supplémentaires sur la situation de la résistance aux acaricides dans les pays étudiés. Ainsi, elles ont permis de détecter les premiers cas de résistance de la tique des bovins à l’amitraz en Argentine, elles ont montré l’ampleur de la résistance au fipronil au Brésil et mis en évidence l’importance de la résistance aux OP et aux SP dans les différents pays ainsi. De plus, elles ont permis de détecter quelques cas isolés de résistance ou de suspicion de résistance aux ML au Brésil, en Argentine et en Afrique du Sud.
    Afin de compléter ce diagnostic in vitro de la résistance aux acaricides, une PCR multiplex a été mise au point pour détecter simultanément trois mutations ponctuelles connues comme étant impliquées dans la résistance aux SP chez R. (B.) microplus. Cette PCR a été utilisée pour tester les échantillons de tiques provenant du Brésil, d’Argentine, d’Afrique du Sud et d’Australie dont le phénotype avait été préalablement évalué avec le LTT, ainsi que quelques souches supplémentaires du Mexique. Il est apparu que les trois mutations ont des distributions géographiques distinctes et qu’elles résultent dans des phénotypes de résistance différents.
    Summary
    Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a one-host cattle tick which has a tropical and subtropical distribution. This major ectoparasite has a very important economic impact on cattle husbandry throughout its area of distribution. In Brazil, for example, the loss due to its direct and indirect effects was estimated at 2 billion US dollars in 2000. The control of cattle tick populations relies mainly on acaricides and the intensive use of such products has led to the development of resistance to most of the acaricide classes available on the market. Monitoring of resistance is essential on a local scale, so that producers can obtain information on the resistance pattern of the tick population established in their farm and advice on using alternative compounds. In addition, on a global scale, monitoring of resistance may help to slow down the development of resistance and to extend compound lifespan.
    Bioassays are very useful tools to monitor resistance. The Food and Agriculture Organisation of the United Nations (FAO) recommends two in vitro tests: the Laval Packet Test (LPT) and the Adult Immersion Test (AIT). Each test has its own advantages and disadvantages: the LPT is a laborious and time-consuming test while the AIT requires many ticks for testing. These two flaws limit the number of compounds and doses which can be tested, and therefore the information which can be obtained. Hence, we developed a new test named Larval Tarsal Test (LTT), to overcome these limitations. The LTT is a time effective test requiring small numbers of ticks which is based on the distribution of tick eggs in pre-treated wells of microtiter plates. The plates are incubated until larvae hatch and get exposed to the acaricidal compounds. Then, the evaluation of the susceptibility of the ticks is based on the assessment of larva mortality. The ability of the LTT to detect resistance was compared to the FAO-recommended LPT by testing a susceptible and a resistant reference laboratory strain with 9 compounds of 5 major acaricide classes: organophosphates (OP), synthetic pyrethroids (SP), amidines, macrocyclic lactones (ML), and phenylpyrazols. The LTT provided satisfactory dose-response curves, was as sensitive as the LPT and required much lower doses of the acaricides to obtain equal mortality levels.
    Having demonstrated the suitability of the LTT, this test was used to evaluate the acaricide resistance pattern of field populations from Argentina, South Africa and Australia, which were shipped to Switzerland for testing. This study proved the ability of the LTT to detect resistance in field populations and the test was subsequently modified to simplify the equipment required and to be carried out in other laboratories. The LTT was then carried out in two Brazilian laboratories testing tick field populations from that country and, some of these populations were also tested with the LPT for additional comparison. Again, the LTT proved to be a time-effective and appropriate test to detect acaricide resistance in field populations with, this time, an even higher sensitivity than the LPT. Furthermore, these studies provided additional data on the resistance in the four sampled countries. This study detected the first cases of resistance to amitraz in Argentina, found widespread fipronil resistance in Brazil, widespread OP and SP resistance in the different countries, and occasional cases of resistance or suspected resistance to ML in Brazil, Argentina and South Africa.
    Finally, to complete this in vitro diagnosis of acaricidal resistance, a multiplex PCR was developed allowing the simultaneous detection of three single nucleotide substitutions known to confer resistance to SP in R. (B.) microplus. This assay was used to screen the tick samples originating from Brazil, Argentina, South Africa and Australia whose phenotype to SP had been determined by the use of the LTT, as well as some additional tick strains from Mexico. The three mutations were found to have distinct geographical distributions and to result in different resistance phenotypes.