Faculté des sciences

Analyse de tannins inhibiteurs de la stilbène oxydase produite par Botrytis cinerea Pers.: Fr

Perret, Camille ; Tabacchi, Raphaël (Dir.)

Thèse de doctorat : Université de Neuchâtel : 2001 ; 1591.

Grey mould is one of the most important diseases of grapes. Flowering clusters are infected by the fungus Botrytis cinerea, but it does not develop until ripening. This latency is probably maintained by an unfavourable environment, corresponding to the production of phytoalexins (resveratrol (1), pterostilbene (2) and e-viniferin (3)). Some varieties, as Gamaret, are very resistant to the fungus... More

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    Résumé
    Botrytis cinerea est le champignon pathogène responsable de la pourriture grise. Cette maladie est économiquement importante, car elle détruit chaque année une partie des récoltes viticoles et horticoles (fraises, concombres, tomates…). Ce champignon infecte les baies de raisin à la floraison, mais reste latent durant toute la période estivale pour reprendre son développement à la véraison, provoquant le pourrissement de la grappe. Certaines variétés, comme le Gamaret, sont résistantes à l'attaque par Botrytis cinerea et d'autres, comme le Gamay, y sont très sensibles. Ce phénomène de latence serait entre autre attribué à la production de phytoalexines par la vigne (resvératrol (1), pterostilbène (2) et e-viniférine (3)) inhibant le développement du champignon de juin à septembre. Le resvératrol et le pterostilbène font partie de la famille des stilbènes et sont des composés synthétisés par la plante suite à un stress. Ces molécules peuvent s'oxyder sous l'action d'enzymes, la stilbène oxydase et les peroxydases, pour former respectivement le resvératrol trans-déhydrodimère (4), le pterostilbène déhydrodimère (5) et l'e-viniférine. Le resvératrol est faiblement toxique envers Botrytis cinerea, ce qui n'est pas le cas pour le pterostilbène, qui est le composé le plus actif synthétisé par la plante. L'e-viniférine et le resvératrol trans-déhydrodimère montrent une toxicité modérée contre le champignon. Quant au pterostilbène déhydrodimère, il est totalement inactif envers Botrytis cinerea. Lors d'un stress abiotique (par exemple l'attaque par un agent pathogène), la concentration de resvératrol augmente, alors que le pterostilbène tend à disparaître complètement. La stilbène oxydase est une enzyme produite par Botrytis cinerea qui est donc capable d'oxyder les stilbènes. Cette enzyme est inhibée par les tanins présents dans la plante. Ce travail met en évidence l'inhibition de l'enzyme par les tanins extraits de Gamay et de Gamaret en fonction de leur poids moléculaire et de la maturité du raisin. Les tanins de la grappe sont composés d'un mélange de proanthocyanidines et de proanthocyanidines galloylées. Ces molécules sont reliées entre-elles par une liaison carbone-carbone, formant un polymère de taille variable (entre 2 et 50 unités monomériques). Ces composés sont très polaires dû à un grand nombre de groupements hydroxyles, et de se fait, sont difficile à séparer et à analyser. La spectrométrie de masse s'est avérée être la méthode de choix pour la caractérisation de ces polymères. La deuxième partie de ce travail décrit le développement de méthodes d'analyse des tanins par différentes techniques en spectrométrie de masse. Malgré l'utilisation d'ionisations douces, telle que l'électrospray, il n'a pas été possible de détecter des ions au-delà de 3000 uma. L'utilisation de différents types d'analyseurs (Ion Trap et FT-ICR/MS) ne n'a pas permis de contrer ce problème. De ce fait, nous avons utilisé la technique d'ionisation MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) couplé a un analyseur TOF (Time-Of-Flight). Les résultats obtenus permettent de détecter des ions au-delà de 4000 uma
    Summary
    Grey mould is one of the most important diseases of grapes. Flowering clusters are infected by the fungus Botrytis cinerea, but it does not develop until ripening. This latency is probably maintained by an unfavourable environment, corresponding to the production of phytoalexins (resveratrol (1), pterostilbene (2) and e-viniferin (3)). Some varieties, as Gamaret, are very resistant to the fungus and some, as Gamay, are very sensitive. These stilbenic compounds are present in vine at low concentration. Enzymes, such as stilbene oxidase and peroxidases, are able to oxidize these molecules to form, respectively, resveratrol trans-dehydrodimer (4), pterostilbene dehydrodimer (5) and e-viniferin. As described in the literature, resveratrol is not toxic against Botrytis cinerea, compared to pterostilbene, which is the most toxic compound produced by the plant. e-viniferin and resveratrol trans-dehydrodimer show higher activity than resveratrol. Pterostilbene dehydrodimer is not active against the fungus. Under stress (for example, when the plant is attacked by a pathogen agent), the concentration of resveratrol increases and the pterostilbene tends to disappear. Stilbene oxidase is an enzyme produced by Botrytis cinerea, which might oxidize stilbenic compounds. The tannins present in the grape inhibit this enzyme. This work describes the enzyme inhibition by tannins extracted from Gamay and Gamaret varieties according to their molecular weights and grape maturity. Grape tannins are composed of proanthocyanidins and galloylated proanthocyanidins. These molecules are linked by a carbon-carbon bond, generating a polymer of various size (between 2 or 50 monomeric units). These compounds are very polar and thereby difficult to separate and analyse. Mass spectrometry is a suitable method for the analysis of such polymers. The second part of this work describes the development of new analytical methods for the characterization of tannins by mass spectrometry. Soft ionization as electrospray, did not allow the detection of ions up to 3000 uma. The use of different analysers such as Ion Trap and FT-ICR/MS did not help us for solving this problem. For that reason, we tried the MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) ionization technique coupled to a Time-Of-Flight analyser, which permits the detection of higher masses up to 4000 uma