Faculté des sciences

Porphobilinogène synthase (PBGS) d'Escherichia coli : études cinétiques et rayons X , deux outils permettant la caractérisation du site actif et la détermination du mécanisme enzymatique

Homberger-Zizzari, Eleonora ; Neier, Reinhard (Dir.)

Thèse de doctorat : Université de Neuchâtel : 2002 ; 1637.

The aim of this PhD thesis was to acquire new informations allowing the determination of the mechanism for the transformation of two d-aminolevulinic acid molecules (1) into porphobilinogen (2). This reaction is catalysed by the enzyme porphobilinogen synthase (PBGS, EC 4.2.1.24), which is the second dedicated enzyme in the biosynthesis of tetrapyrrolic compounds such as heme, chlorophyll, etc.... More

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    Résumé
    Le but de ce travail de thèse consistait à fournir de nouvelles informations afin d'étudier le mécanisme enzymatique proposé pour la transformation de deux molécules d'acide d-aminolévulinique (1) en porphobilinogène (2). Cette réaction est catalysée par une enzyme, la porphobilinogène synthase (PBGS, EC 4.2.1.24), qui est la deuxième enzyme impliquée dans la biosynthèse des composés tétrapyrroliques comme l'hème, la chlorophylle, etc. Trois mécanismes, abrégés Shemin, Jordan I et Jordan II, furent proposés. Les différences principales rencontrées sont le site de reconnaissance de la première molécule de substrat, soit le site A soit le site P, et la formation de la première liaison inter-substrat, soit une liaison C-C soit une liaison C-N. Uniquement la PBGS issue d'Escherichia coli fut utilisée dans nos expériences. Durant ce travail, une nouvelle charge d'enzyme fut isolée et purifiée. Une différence de stabilité fut rencontrée selon le type de tampons utilisé : phosphate de sodium ou de potassium. Les KM1 et KM2, spécifiques pour le site P et pour le site A, furent déterminés et comparés au premier résultat obtenu par Engeloch-Jarret. Divers inhibiteurs, soit des analogues de substrat, soit des analogues d'intermédiaires (Jordan I, Jordan II ou Shemin) furent testés sur la PBGS. L'analyse des données cinétiques ainsi que le type d'inhibition rencontrée nous permirent de faire des corrélations entre le site de reconnaissance impliqué (A ou P) et le type d'inhibition observé. L'ensemble des résultats obtenus nous incita à privilégier un des mécanismes cités ci-dessus. La succinylacétone est reconnue comme un inhibiteur puissant de la PBGS et montrait un comportement du type slow binder avec la PBGS d'E. coli. Divers composés, analogues de cette succinylacétone, furent synthétisés et testés afin de mieux comprendre les raisons de cette forte interaction avec l'enzyme. Les composés b-dicétones étaient connus pour leur stabilisation au site actif des enzymes, possédant une lysine importante pour l'activité catalytique, via une amide vinylogue. La longueur d'onde de l'absorption ainsi que le coefficient d'extinction permirent de déterminer la configuration de l'amide vinylogue liée au site actif de l'enzyme (trans-s-trans ou cis-s-trans/cis-s-cis). La succinylacétone fut incubée avec la PBGS d'E. coli et le l (en nm) ainsi que l'e (en M-1 cm-1) furent calculés, ce qui permit de confirmer la configuration cis-s-trans au complexe succinylacétone-enzyme.
    Summary
    The aim of this PhD thesis was to acquire new informations allowing the determination of the mechanism for the transformation of two d-aminolevulinic acid molecules (1) into porphobilinogen (2). This reaction is catalysed by the enzyme porphobilinogen synthase (PBGS, EC 4.2.1.24), which is the second dedicated enzyme in the biosynthesis of tetrapyrrolic compounds such as heme, chlorophyll, etc. Three mechanisms, commonly called Shemin, Jordan I and Jordan II, have been proposed. The major differences between these mechanisms are the recognition site of the first substrate molecule, A site or P site, and the formation of the first inter-substrate bond, C-C bond or C-N bond. The E. coli PBGS has been used for all experiments of this work. A new enzyme batch was isolated and purified. A difference in the enzyme stability was detected as a function of buffer used : sodium or potassium phosphate. The KM1 et KM2, characteristic for the P site and the A site, were determined and compared to that obtained by Engeloch-Jarret. Various inhibitors, such as substrate or intermediate analogues (Jordan I, Jordan II or Shemin) had been tested on the PBGS. The kinetic data analysis and the inhibition behaviour allowed us to correlate the involved recognition site with the observed inhibition type. All the results were in favour of one of the above mechanisms. The succinylacetone is a potent inhibitor of the PBGS and showed a slow binding inhibition with the E. coli PBGS. Some compounds, analogues of the succinylacetone, were synthesized and tested with the aim of better understanding the strong interaction between the succinylacetone and the enzyme. The b-diketone compounds were known to stabilize themselves as a vinylogous amide at the active site of enzymes, trapping an important active site lysine. The absorption wavelength and the extinction factor allowed us to distinguish between the different configurations of the vinylogous amide (trans-s-trans or cis-s-cis/cis-s-trans). Succinylacetone was incubated with E. coli PBGS and the l (in nm) as the e (in M-1 cm-1) were calculated. The results confimed the cis-s-trans configuration for the enzyme-inhibitor complex.