Technologies du vivant - Life Technologies

Développement de la mobilité ionique pour la détection des sites de sumoylation des protéines = Identification of SUMOylation Sites using High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility (FAIMS) coupled to a Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer

Pfammatter, Sibylle ; Kalman, Franka (Dir.)

Mémoire de bachelor : Haute Ecole d'Ingénierie, 2014.

SUMOylation is a post-translational modification of proteins that is involved in different cellular processes including mitosis, DNA replication and transcription. However its detection by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS) can be challenging due to its low abundance and dynamic regulation. High Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry (FAIMS) helps in... More

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    Résumé
    L’utilisation de High-Field Assymetric Waveform Ion Mobility (FAIMS) résulte en une diminution significative du bruit de fond en LC-MS. Grâce au fractionnement effectué, il est possible d’identifier des peptides de faible abondance par LCMS/ MS. La performance de FAIMS a été testée en comparant des analyses de digestats trypsiques de lysat de cellules HEK293 avec et sans FAIMS par LCMS/ MS. 8260 peptides ont été identifiés (1165 protéines) avec FAIMS et seulement 4820 peptides (734 protéines) sans FAIMS. Quand un nombre représentatif de peptides synthétiques SUMO ont été ajoutés dans un digestat de HEK293, les analyses nano-LC MS ont montré une limite de détection 18 fois plus faible lorsque FAIMS y est couplé. Finalement, la sumoylation est une des premières réponses cellulaires au stress thermique. Donc pour augmenter la concentration de protéines sumoylées, nous avons effectué un choc thermique (43°C) sur des cellules HEK293 exprimant SUMO3 mutante. Un enrichissement de SUMOIylation dans la fraction nucléaire a été observé après 60 min par immunobuvardage. Une analyse LC-FAIMS-MS/MS a donné une augmentation de 2 fois du nombre de peptides SUMOylés identifiés après choc thermique.
    Summary
    SUMOylation is a post-translational modification of proteins that is involved in different cellular processes including mitosis, DNA replication and transcription. However its detection by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS) can be challenging due to its low abundance and dynamic regulation. High Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry (FAIMS) helps in eliminating background ions which allows to improve the limit of detection. FAIMS separation is based on the differential mobility of ions between low to high electric field. In a preliminary experiment performed on a tryptic digest of HEK293 proteins, we identified 8260 peptides (1165 proteins) with FAIMS compared to 4820 peptides (734 proteins) without FAIMS. The limit of detection was 12 fmol with FAIMS for synthetic SUMO peptides spiked in a complex tryptic digest and 183 fmol without FAIMS. A LC-MS analysis with FAIMS of a mutant SUMO3 HEK293 cell line resulted in a 3-fold increase in the identification of SUMO peptides.