Technologies du vivant - Life Technologies

Aufbau von eukaryotischen Zellkultur Systemen zur Messung der Bioaktivität von estrogenen Stoffen

Machi, Bastien ; Schnyder, Wilfried Andlauer, Bruno (Dir.)

Mémoire de bachelor : HES-SO Valais, 2009.

Des tests de quantification d’oestrogènes ont été menés avec trois souches de levures recombinantes, les souches DP 450, DP 451 et DP 452. La souche DP450 exprime l’ERα, lasouche DP 451 exprime l’ERβ, et la souche DP 452 sert de contrôle négatif et n’exprime doncpas de récepteur oestrogénique. Les trois souches contiennent comme reporter protéine la uciférase qui, en présence... More

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    Résumé
    Des tests de quantification d’oestrogènes ont été menés avec trois souches de levures recombinantes, les souches DP 450, DP 451 et DP 452. La souche DP450 exprime l’ERα, lasouche DP 451 exprime l’ERβ, et la souche DP 452 sert de contrôle négatif et n’exprime doncpas de récepteur oestrogénique. Les trois souches contiennent comme reporter protéine la uciférase qui, en présence d’oestrogènes, est transcrite grâce à l’induction positive des ER. La teneur en luciférase du milieu est ensuite mesurée par la luminescence dégagée en présence de luciférine. Les essais pratiqués dans le cadre de ce projet ont montré que la croissance de la souche DP450 connaît une phase de latence de 4h, une phase exponentielle de 23h et l’apparition de la phase stationnaire après 27h de culture. Cette souche possède un μmax de 0.56 h-1. La phase de latence de la souche DP 451 dure 3.17h, sa phase exponentielle 23h, et l’apparition du plateau au bout de 26h. Son μmax est de 0.39h-1. Enfin la souche DP 452 possède une phase de latence de 3.17h, une phase exponentielle de 21h et une phase stationnaire i après 24h de culture. Une influence prononcée sur la vitesse de croissance et sur la densité cellulaire maximale de la souche DP 450 est remarquée à une concentration de 1 μM d’E2. Cet effet est moins marqué sur la souche DP 451. La croissance de la souche DP 452 est augmentée par la présence de E2, mais l’OD600 maximale atteinte en présence de ce produit est plus faible. Les tests de luminescence n’ont pas marché à Sion, c’est pourquoi d’autres tests ont été entrepris à Genève, dans le laboratoire qui a fourni les souches. Les tests de Genève ont révélé que l’induction de la luciférine dans les souches DP 450 et DP 451 augmente avec le temps et la concentration en oestrogènes. Il n’y a en revanche pas d’induction dans la souche DP 452. D’autres essais ont démontré qu’aucun traitement des cellules après induction n’est nécessaire pour le bon déroulement du test car il semble que la luciférine soit majoritairement excrétée. Des tests de comparaison du potentiel d’induction de l’E2 et de la génistéine ont également été menés, révélant que la génistéine possède une affinité avec l’ERα entre 10-2.5 et 10-4 fois moins que l’E2. Des tests sur les 3 souches après lyophilisation ont montré que DP 450 avait une viabilité de 7%, DP 451 de 18% et DP452 de 50%.