Faculté des sciences de la vie SV, Programme doctoral Neurosciences, Institut interfacultaire de Bioingénierie (SV/STI) IBI1 (Laboratoire de dynamique des cellules souches LDCS1)

Acquisition et recalage informatique d'images confocales de tissus denses : application à l'étude de la papille folliculaire de vibrisse de souris

Fête, Nicolas ; Barrandon, Yann (Dir.) ; Thiran, Jean-Philippe (Dir.)

Thèse Ecole polytechnique fédérale de Lausanne EPFL : 2008 ; no 4105.

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    Summary
    Analysis of the 3D structure of a biological sample is an important step to model cell and tissue dynamics. As a model system, we set up to determine the number of nuclei in a follicular papilla using confocal imaging and 3D computer reconstruction. The follicular papilla is a small mesenchymal ovalshape structure localized at the basis of the hair follicle that is particularly important for hair follicle morphogenesis, and the size of which varies during hair growth. However, little is known on the influence of the hair cycle on the number of cells in a follicular papilla. Fgf5 -/- mice have long hairs (angora phenotype) due to an extended hair cycle, and small dermal papilla. There are several hypotheses to explain the latter observation : there are less cells in Fgf5 -/- dermal papilla than in wild type papilla mutant papilla produces less extra cellular matrix than wild type papilla it is a combination of both To discriminate between these hypotheses, dermal papilla were microdissected from vibrissal follicles occupying the same position on the mystacial pad of same age Fgf5 -/- and wild type mice. Nuclei were stained with a fluorescent dye and the papilla examined under a confocal microscope. Because of dermal papilla thickness, two stacks of images were acquired for each sample (recto and verso acquisitions), registrated using especially implemented computer science program and analyzed. This whole process turned out to be far more complex and cumbersome than anticipated. First, we had to design a special setup in order to be able to make two side scans of samples, second the acquisition time of two stacks of images to cover the entire dermal papilla was rather long, third repositioning and analysis of the images were complex. Nonetheless, the number of nuclei in a dermal papilla was determined with precision. Analysis of dermal papilla obtained at different time of the hair cycle is ongoing. Our work paves the way to the analysis of other biological structures important during skin morphogenesis or regeneration, i.e. the ectodermal placodes. An important lesson of our work is that there is no straightforward imaging and computer science approach when it comes to the biology of complex structures and that the technology needs to be customized to the biological question.
    Résumé
    L'analyse de la structure en 3D d'un échantillon biologique est une étape importante pour la modélisation de la dynamique cellulaire et tissulaire. Nous avons mis au point une méthode pour déterminer le nombre de noyaux d'une papille folliculaire (notre modèle expérimental) en utilisant la microscopie confocale et des techniques informatiques afin d'obtenir une reconstruction en 3D de cet échantillon. La papille folliculaire est une petite structure de forme ovale située à la base du follicule pileux. Elle joue un rôle primordial lors de la morphogénèse du follicule pileux ainsi que lors du cycle pilaire où sa taille varie au cours des différentes phases du cycle. Cependant, l'influence du cycle pilaire sur le nombre de cellules de la papille folliculaire est encore peu connue. Les souris Fgf5 -/- ont des poils plus longs que la normale (phénotype angora) dû à une augmentation du cycle pilaire, mais ont aussi des papilles folliculaires plus petites. Cette dernière observation sur la taille des papilles folliculaires Fgf5 -/- peut s'expliquer par plusieurs hypothèses : Il y a moins de cellules dans les papilles folliculaires Fgf5 -/- que dans celles des souris sauvages Les cellules des papilles folliculaires Fgf5 -/- produisent moins de matrice extracellulaire que celles des papilles folliculaires sauvages Une combinaison des deux hypothèses citées précédemment Afin de départager ces différentes hypothèses, des papilles folliculaires ont été microdisséquées à partir de follicules de vibrisse situés au même endroit sur le museau de l'animal et au même âge sur des souris Fgf5 -/- et sauvages. Les noyaux ont été marqués à l'aide d'un marqueur nucléaire fluorescent, puis les papilles ont été examinées sous un microscope confocal. Du fait de l'épaisseur des papilles folliculaires, deux piles d'images ont été acquises pour chaque échantillon (acquisitions recto et verso), recalées avec un programme informatique spécialement implémenté dans ce but, puis analysées. Ce processus entier s'est avéré bien plus complexe et plus long que nous l'avions anticipé. Premièrement, nous avons dû créer un montage spécial permettant une acquisition recto-verso, deuxièmement le temps d'acquisition pour obtenir deux piles d'images couvrant la totalité du volume de la papille folliculaire s'est avéré très long, et troisièmement les processus de recalage et d'analyse se sont révélés complexes. Malgré cela, le nombre de noyaux de plusieurs papilles folliculaires a pu être déterminé avec précision. L'analyse des papilles folliculaires prélevées à différents points du cycle pilaire est en cours. Ce travail de thèse ouvre la voie à l'analyse d'autres structures biologiques importantes pendant la morphogénèse de la peau ou de sa régénération (par exemple : les placodes ectodermiques). Une leçon importante découlant de ce travail est qu'il n'y a pas de techniques faciles et rapides d'imagerie et d'informatique lorsque l'on veut étudier des structures biologiques complexes, et qu'il est donc nécessaire que ces technologies soient adaptées ou modifiées pour chaque nouvelle question biologique.