Faculté de l'environnement naturel, architectural et construit ENAC, Section des sciences et ingénierie de l'environnement, Institut des sciences et technologies de l'environnement ISTE (Laboratoire de biotechnologie environnementale LBE)

Molecular characterization of key enzymes involved in dehalorespiration with tetrachloroethene

Maillard, Julien ; Holliger, Hans Christof (Dir.)

Thèse sciences Ecole polytechnique fédérale de Lausanne EPFL : 2004 ; no 3105.

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    Summary
    Summary Chloroethenes, and most particularly tetra- (PCE) and trichloroethene (TCE) are major groundwater pollutants due to their extensive industrial use as solvents since the 1920s. The strong electronegativity of the chlorines renders them very stable under aerobic conditions. However, biodegradation of chloroethenes under anaerobic conditions has been shown to be a promising strategy for remediation of chloroethene-contaminated sites. To date around fifteen bacterial strains have been isolated with the property of using chloroethenes as terminal electron acceptor in a process called dehalorespiration. Anaerobic dehalorespiring bacteria show an unequal chloroethene substrate range and an unequal extent of dechlorination. While most of the dehalorespiring bacteria dechlorinate PCE and TCE to cis-1,2-dichloroethene cis-1,2-DCE) and belong to the phyla Firmicutes, δ- and ε-Proteobacteria, a few strains of the genus Dehalococcoides affiliated with the phylum Chloroflexi and are able to dechlorinate cis-1,2-DCE and vinyl chloride (VC) to the non-toxic ethene. Dehalobacter restrictus and Dehalococcoides isolates were found to be completely restricted to dehalorespiration which gave rise to some basic evolutionary questions. Identification of the key enzyme in the dechlorination reaction, the reductive dehalogenase, has revealed a new class of enzymes containing a corrinoid and two ironsulfur clusters as cofactors. At the beginning of this thesis, nine chloroethene reductive dehalogenases have been characterized on biochemical level, while only little information was available on molecular level. Therefore, the overall goal of this thesis was to characterize on a molecular level the reductive dehalogenases involved in tetrachloroethene dehalorespiration and to get some indications on the evolution of this novel anaerobic respiration process. Starting from the N-terminal sequence of the PCE reductive dehalogenase (PceA) of Dehalobacter restrictus and from a conserved amino acid stretch found in two already sequenced reductive dehalogenases, a degenerate PCR approach allowed the isolation of the gene encoding PceA. Comparison with unpublished data from Desulfitobacterium sp. strain PCE-S showed 100% sequence identity. The full sequence of the pceAB gene of strain PCE-S helped to isolate the corresponding gene cluster from D. restrictus and Desulfitobacterium hafniense strain TCE1, which has also been shown to contain an identical N-terminal sequence. Sequence analysis confirmed the presence of a Twin-Arginine Translocation (Tat) signal peptide, which is involved in the incorporation of the reductive dehalogense into the cytoplasmic membrane. Detailed analysis of the iron-sulfur cluster binding motifs present in PceA of D. restrictus and the chlorophenol reductive dehalogenase (CprA) of Desulfitobacterium dehalogenans revealed differences in the second motif, which may explain results obtained by EPR spectroscopy, namely the presence of two [4Fe-4S] clusters in the former enzyme and the presence of one [3Fe-4S] and one [4Fe-4S] cluster in the latter one. Structure breaking residues such as glycine and proline are present at the two extremities of the ten amino acid stretch separating the first and second ironbinding cysteine residues of the second motif in PceA, but not in CprA. This primary structure probably allows the formation of a loop in the tertiary structure and the participation of the first cyteine as a ligand in a [4Fe-4S] cluster. In both new sequences, the presence of a short gene (pceB) encoding a hydrophobic protein with three conserved trans-membrane α-helices was confirmed, indicating a possible role in anchoring the catalytic unit of the reductive dehalogenase into the membrane. The complete sequence identity observed in the newly isolated reductive dehalogenases raised the question of a possible horizontal gene transfer between Dehalobacter restrictus and Desulfitobacterium hafniense strain TCE1. Therefore, the flanking regions of the reductive dehalogenase genes (pceAB) in Desulfitobacterium hafniense strain TCE1 and Dehalobacter restrictus were investigated. This study revealed the presence of a composite transposon (named Tn-Dha1) in strain TCE1 bordered with two identical insertion sequences (ISDha1, including the transposase gene tnpA1) and containing six open reading frames: the already characterized pceAB, two genes (pceCT) related to members of the o-chlorophenol reductive dehalogenase gene cluster of Desulfitobacterium dehalogenans, and two possibly truncated genes with homology to another transposase (tnpA2) and to a subunit of the Tat machinery (tatA), respectively. In contrast, only the pceABCT gene cluster (i.e. without the transposon structure and the other two genes) was present in Dehalobacter restrictus, indicating that the genes encoding the key enzymes for the dechlorination activity are stably integrated into the genome. A detailed investigation of Tn-Dha1 by PCR and Southern blot analysis indicated that Tn-Dha1 may form various circular molecules, an indication for an active mobile genetic element. A model for the transposition of Tn-Dha1 was proposed, in which the transposon may excise from the chromosome and circularize, forming an unstable structure with two abutted ISDha1. The strong promoter formed by the junction of both IS would lead to high expression of the transposase, which in turn reacts with the circular element by either re-integrating it in the chromosome or excising one or both ISDha1 from that element. The resulting structures would be single IS, IS tandems and circular molecules with one or no remaining IS, both latter structures being dead-end products of the transposition event. The hypothesis of mobile reductive dehalogenase genes was also investigated using a genomic approach in preliminary sequence data (released by The Institute for Genome Research, TIGR) of the genome of Dehalococcoides ethenogenes, a dehalorespiring bacterium capable to completely dechlorinate PCE to ethene. The genome was shown to contain the extraordinary number of eighteen different copies of reductive dehalogenase genes, including the well characterized tceA. A genomic signature of D. ethenogenes was obtained by calculating the frequency of 4-letter DNA words along the genome and was graphically represented. Local disruptions of the genomic signature in certain segments of the genome were highlighted, corresponding to DNA, which may have been acquired by horizontal gene transfer, so-called original regions. It revealed that from the eighteen putative reductive dehalogenase genes present in the genome of D. ethenogenes, fifteen were located in original regions. Moreover, several genes encoding for recombinases (transposase, integrase) were found within these original regions, strongly indicating that these may have been acquired horizontally. The complete electron transport chain leading the electrons to the reductive dehalogenase has not yet been characterized for any of dehalorespiring bacteria and the direct electron-donor has not yet been elucidated for any of reductive dehalogenases. Therefore, the presence of cytochromes in cells of Desulfitobacterium hafniense strain TCE1 was investigated with regard to the presence or absence of PCE in the growth medium. Detection of cytochromes using a sensitive detection method based on chemiluminescence revealed a strongly enhanced signal in the membrane fractions of strain TCE1 cells grown on PCE instead of fumarate as terminal electron acceptor. Western blot analysis revealed the presence of a 45 kDa protein in membrane fraction, corresponding most probably to a c-type cytochrome. UV-visible spectroscopy confirmed the presence of c-type cytochromes in membrane fractions. This study, although further investigations are needed, indicated that a c-type cytochrome may be involved in the direct electron transfer to the PCE reductive dehalogenase of D. hafniense strain TCE1. At present, numerous sequences of reductive dehalogenase genes have been reported and deposited on sequence databases, revealing the great interest shown for this new anaerobic respiration pathway. While several degenerate PCR approaches have led to the isolation of 22 mostly partial genes, analysis of preliminary genome sequence data from Dehalococcoides ethenogenes and Desulfitobacterium hafniense strain DCB-2 has revealed 18 and 6 sequences, respectively. Sequence alignment and homology analysis of the 66 reductive dehalogenases genes available in August 2004 revealed four main clusters, two corresponding to chlorophenol and chloroethene reductive dehalogenases found in the phylum Firmicutes, one with sequences mostly isolated from ε-Proteobacteria, and one containing most of the genes isolated from the genus Dehalococcoides. Hence, the reductive dehalogenases appear to be rather conserved wihtin phylogenetic groups, indicating a relatively ancient enzyme class. Reductive dehalogenases show some features such as the presence of a Tat signal peptide and iron-sulfur clusters that are common to most of terminal reductases. However, the presence of a corrinoid at the catalytic center and of several specific conserved amino acid stretches makes them a new class of anaerobic reductases. Finally, the strong variation in the topology of the dehalorespiration chain and the variable presence and involvement of different electron transferring components such as quinones and cytochromes in dehalorespiring bacteria indicate that reductive dehalogenases may have been integrated into existing respiration chains rather than that dehalorespiration has evolved as a whole.
    Résumé
    Depuis 1920, les chloroéthènes, et plus particulièrement le tetra- (PCE) et le trichloroéthène (TCE) sont devenus des polluants majeurs dans les eaux souterraines de par leur utilisation intensive en tant que solvants dans l'industrie. La forte électronégativité des atomes de chlore leur confère une grande stabilité en conditions aérobies. Cependant, en conditions anaérobies, la biodégradation des chloroéthènes par des microorganismes s'est avérée être une technique de dépollution prometteuse pour favoriser leur élimination au sein des sites contaminés. A ce jour, une quinzaine de souches bactériennes ont été isolées avec la capacité d'utiliser les chloroéthènes comme accepteur final d'électrons au cours d'un processus appelé déhalorespiration. Alors que la plupart des souches isolées, appartenant aux phyla Firmicutes, Protéobactéries δ et ε, sont capables de déchlorurer le PCE et le TCE principalement jusqu'au cis-1,2-dichloroéthène (cis-1,2-DCE), quelques représentants du genre Dehalococcoides, affiliés au phylum Chloroflexi, peuvent en outre déchlorurer le cis-1,2-DCE et le chlorure de vinyl (VC), rejetant ainsi de l'éthène, considéré comme non-toxique, dans l'environnement. Certaines bactéries, telles que Dehalobacter restrictus, ainsi que les membres du genre Dehalococcoides, sont même totalement dépendantes des chloroéthènes pour leur croissance, ce qui donna naissance à des questions d'ordre évolutif. L'identification des enzymes-clés de la réaction de déchloruration, appelées déhalogénases réductrices, a révélé une nouvelle classe d'enzymes contenant un corrinoïde et deux centres fersoufre comme cofacteurs. Neuf membres de cette nouvelle classe d'enzymes étaient caractérisés sur le plan biochimique au début de cette thèse, et très peu d'information était disponible au plan moléculaire. Ainsi le but principal de cette thèse était de caractériser sur le plan moléculaire les déhalogénases réductrices impliquées dans la déhalorespiration du tetrachloroéthène, et d'obtenir des indications concernant l'évolution de ce nouveau processus de respiration anaérobie. A partir de la séquence N-terminale de la PCE déhalogénase réductrice (PceA) de Dehalobacter restrictus, et d'une séquence de huit acides aminés conservée dans deux autres déhalogénases réductrices, une approche de type PCR dégénérée a permis l'isolement du gène pceA de D. restrictus. La comparaison de cette nouvelle séquence, encore partielle, avec une séquence similaire de Desulfitobacterium sp. PCE-S a révélé une identité proche de 100%. Avec l'aide de cette dernière, la séquence totale des gènes pceAB a été isolée à partir de Dehalobacter restrictus, mais également de Desulfitobacterium hafniense TCE1. L'analyse de cette nouvelle séquence confirma la présence d'un peptide signal de type Tat (pour Twin-Arginine Translocation), connu pour être impliqué dans l'incorporation de l'enzyme dans la membrane cytoplasmique de la bactérie. Une analyse détaillée des motifs de liaison des centres fer-soufre présents dans les séquences de la PCE déhalogénase réductrice de Dehalobacter restrictus et de la chlorophénol (CP) déhalogénase réductrice de Desulfitobacterium dehalogenans a mis à jour des différences structurales dans le deuxième motif. Ces différences corroborent les résultats obtenus par le passé au moyen de la spectroscopie RPE (résonance paramagnétique de l'électron). En effet, la présence de deux centres [4Fe-4S] dans l'enzyme de D. restrictus et celle d'un centre [4Fe-4S] et d'un centre [3Fe-4S] dans l'enzyme de D. dehalogenans peut être expliquée par la présence dans la première enzyme, et non dans la dernière, de résidus glycine et proline aux extrémités du peptide séparant les résidus cystéine, responsables de lier les atomes de fer. Cette structure primaire de la chaîne polypeptidique permet très probablement la formation d'une boucle dans la structure tertiaire ainsi que la participation du premier résidu cystéine à la formation du deuxième centre [4Fe-4S]. En outre, le gène pceB code pour une petite protéine à caractère hydrophobe,contenant trois hélices a structuralement conservées, indiquant un possible rôle dans l'ancrage dans la membrane de la sous-unité catalytique de la déhalogénase réductrice (PceA). L'identité parfaite de séquence des déhalogénases réductrices isolées à partir de Dehalobacter restrictus et de Desulfitobacterium hafniense TCE1 a soulevé la question d'un possible transfert horizontal de gène entre ces deux souches. C'est pourquoi les régions voisines des gènes pceAB ont fait l'objet d'une nouvelle investigation. Cette étude a révélé la présence dans le génome de D. hafniense TCE1 d'un transposon composite (appelé Tn-Dha1), bordé par deux séquences d'insertion identiques (ISDha1, incluant le gène pour la transposase, tnpA1) et englobant six autres gènes : les gènes pceAB, préalablement caractérisés ; deux gènes (pceCT) montrant une homologie avec des membres d'un groupe de gènes impliqués dans la synthèse de la CP déhalogénase réductrice de D. dehalogenans ; et finalement deux autres gènes potentiellement tronqués avec une homologie envers une autre transposase (tnpA2) et une sous-unité de la machinerie Tat (tatA), respectivement. Chez Dehalobacter restrictus, par contre, seul le groupe de gène pceABCT a été observé (c'est-à-dire sans la présence de la structure du transposon et des deux autres gènes), indiquant que les gènes responsables pour les enzymes-clés impliquées dans l'activité déchlorurante sont stables dans le génome de D. restrictus. Une étude détaillée de Tn-Dha1 au moyen de la PCR et de l'analyse par Southern blot a montré que le transposon peut former différentes molécules circulaires, attestant de l'activité de cet élément génétique mobile. Sur la base des résultats obtenus ici, un modèle de transposition de Tn-Dha1 a été proposé, selon lequel le transposon peut s'exciser du chromosome et former une molécule circulaire, contribuant ainsi à la formation d'une structure instable avec deux ISDha1 côte à côte. En effet, le fort promoteur créé par la jonction des deux IS doit conduire à une surexpression de la transposase, qui à son tour réagit avec la structure circulaire soit en la réintégrant dans le chromosome, soit en y excisant un, voire les deux IS. Les structures résultant de ce phénomène seraient des IS isolées, un tandem d'IS, ainsi que des molécules circulaires contenant un ou aucun IS, ces dernières pouvant être considérées comme des déchets du processus de transposition. L'hypothèse selon laquelle les bactéries déhalorespirantes s'échangeraient les gènes-clés de la déhalorespiration par transfert de gène horizontal a également été testée au moyen d'une approche de type génomique. Les données issues du projet de séquençage du génome de Dehalococcoides ethenogenes (établie par « The Institute for Genome Research », TIGR), une bactérie capable de déchlorurer le PCE jusqu'à l'éthène et dont il a été montré qu'elle contenait jusqu'à 18 copies différentes de gènes codant potentiellement pour des déhalogénases réductrices, ont été analysées au moyen d'un outil bioinformatique permettant d'attribuer une signature génomique à l'ensemble de la séquence et d'en étudier les variations tout au long du génome. Pour ce faire, la fréquence des mots d'ADN de 4 lettres a été calculée au fil du génome et représentée graphiquement. Ainsi des perturbations locales de la signature génomique ont été mises en évidence dans certains segments du génome, appelés régions originales, correspondant à de l'ADN présumé avoir été acquis par transfert horizontal. Cette analyse révéla que des 18 copies de déhalogénases réductrices présentes dans le génome de D. ethenogenes, 15 d'entre elles sont localisées à l'intérieur de ces régions originales. De plus, de nombreux gènes codant pour des recombinases (transposase, integrase) ont été trouvés à l'intérieur de ces mêmes régions, corroborant l'hypothèse d'un transfert horizontal de gène. Pour aucune bactérie déhalorespirante, ni la chaîne de transport d'électrons menant les électrons à la déhalogénase réductrice, ni le donneur direct d'électrons pour aucune déhalogénase réductrice n'ont été elucidés. C'est pourquoi la présence de cytochromes au sein des cellules de Desulfitobacterium hafniense TCE1 a été investiguée en fonction de la présence ou absence de PCE dans le milieu de culture. Ainsi la détection des cytochromes au moyen d'une méthode sensible basée sur la chémiluminescence a révélé un signal fortement amplifié dans la fraction membranaire de cellules cultivées sur PCE comme accepteur final d'électrons, en comparaison de la même fraction à partir de cellules cultivées sur acide fumarique. Une analyse de type Western blot a mis en évidence une protéine d'environ 45 kDa dans la fraction membranaire, correspondant très probablement à un cytochrome de type c. Une analyse des mêmes échantillons au moyen de la spectroscopie UV-visible a confirmé ces résultats. Bien que cette étude requiert d'autres analyses, une forte indication selon laquelle un cytochrome de type c serait impliqué dans le transfert direct d'électrons vers la PCE déhalogénase réductrice de D. hafniense TCE1 a été apportée. Pendant la durée de cette thèse, de très nombreuses séquences de déhalogénases réductrices ont été déposées dans les banques de données, attestant de l'intérêt de la communauté scientifique pour cette nouvelle forme de respiration anaérobie. Ainsi plusieurs études basées sur une approche de PCR dégénérée ont abouti à l'identification de 22 gènes de déhalogénases réductrices, pour la plupart partiels. Parallèlement, l'analyse des séquences préliminaires des génomes de Dehalococcoides ethenogenes et de Desulfitobacterium hafniense DCB-2 a révélé la présence de 18 et de 6 nouvelles séquences, respectivement. L'alignement de toutes ces séquences (66 au total), ainsi que l'analyse de leur homologie a révélé un classement en quatre groupes principaux, deux correspondant aux déhalogénases réductrices de type chlorophénols et chloroéthènes présentes au sein du phylum Firmicutes, un autre contenant les séquences isolées à partir des Protéobactéries de type ε, le dernier enfin correspondant à l'ensemble des gènes isolés du genre Dehalococcoides. Ainsi les déhalogénases réductrices semblent être conservées au sein des groupes phylogénétiques, formant une classe d'enzymes relativement ancienne. De plus, certaines caractéristiques présentes chez les déhalogénases réductrices, tels que le peptide signal de type Tat, ainsi que les centres fer-soufre, se retrouvent très fréquemment dans l'ensemble des réductases. Cependant, la présence d'un corrinoïde dans le site actif et la présence de plusieurs peptides spécifiques aux déhalogénases réductrices font de ces enzymes une classe à part. Finalement les fortes variations dans la topologie et la composition de la chaîne de transport d'électrons observées parmi les bactéries déhalorespirantes indiqueraient que les déhalogénases réductrices ont très probablement été intégrées à des chaînes de respiration existantes, et non pas que le processus de déhalorespiration a évolué en tant qu'entité distincte.