Technologies du vivant - Life Technologies

Strategies for the study of the trpX role in Streptomyces coelicolor = Stratégies pour l’étude du rôle du gène trpX dans la souche Streptomyces coelicolor

Ledda, Mirko ; Schmid, Sergio (Dir.)

Mémoire de diplôme HES : Haute Ecole d'Ingénierie, 2007.

Objectifs spécifiques Le gène trpX est une petite orf de la souche Streptomyces coelicolor, qui code pour une protéine hypothétique de 63 acides aminés, TrpX, ayant à ce jour, aucune fonction connue. Ce gène est présent dans l’opéron trpA/B/X/C1, codant pour d’importantes protéines impliquées dans le pathway de la biosynthèse du tryptophane, un acide aminé aromatique.... Plus

Ajouter à la liste personnelle
    Résumé
    Objectifs spécifiques Le gène trpX est une petite orf de la souche Streptomyces coelicolor, qui code pour une protéine hypothétique de 63 acides aminés, TrpX, ayant à ce jour, aucune fonction connue. Ce gène est présent dans l’opéron trpA/B/X/C1, codant pour d’importantes protéines impliquées dans le pathway de la biosynthèse du tryptophane, un acide aminé aromatique. L’objectif spécifique de ce travail est l’étude du gène trpX dans la souche S. coelicolor. En particulier : 1) l’étude de l’expression du gène trpX dans la souche S. coelicolor, dans différentes phase de croissance et milieux de culture, par qRT-PCR. 2) l’analyse de la structure de la protéine TrpX, in silico, avec le programme informatique Robetta server. 3) effectuer des EMSAs sur les régions intergéniques de l’opéron trpA/B/X/C1, avec des extraits protéiques brutes des souche de S. coelicolor wt et de mutants trpX. 4) surexprimer et purifier la protéine TrpX produite dans une souche E. coli. 5) surexprimer le gène trpX dans la souche S. coelicolor Résultats Une analyse par Real-Time RT-PCR a montré que le gène trpX n’est pas exprimer constitutivement mais est dépendant de la phase de croissance. Une approche in silico et des analyses précédentes à ce travail, ont montrés que la protéine TrpX est un possible régulateur du gène trpB, un gène impliqué dans la biosynthèse du tryptophane et une prédiction de la stucture tridimensionnelle de TrpX a montré qu’il s’agit d’une protéine liant l’ADN. L’hypothèse la plus probable du rôle de la protéine TrpX dans S. coelicolor, est qu’elle lie une région intergénique de l’opéron trpA/B/X/C1, régulant l’expression génique du gène trpB. Cette hypothèse n’a pas été confirmée par les analyses effectuées durant ce travail (DNA binding assays), donc d’autres essais sont nécessaires, notamment des DNA or RNA binding assays avec des conditions différentes. La protéine His6-TrpX a été surproduite, avec succès, dans E. coli, et sa purification est, à l’heure actuelle, en cours. Cette protéine purifiée pourra être utilisée dans des DNA or RNA binding assays, afin de confirmer l’hypothèse émise précédemment. La surexpression du gène trpX dans S. coelicolor, permettant d’indiquer des voies, afin de comprendre la fonction de trpX n’as pas été obtenues, mais de nouvelles stratégies ont été étudiées et sont désormais en cours.
    Summary
    The emergence of several pathogenic bacteria and the adaptation of part of those resistant to antibiotics currently used, in clinically treatments, needs the research for new antibiotic development and the creation of a “Superhost”, allowing a large scale production of antibiotics. Streptomyces belongs to Actinomycetes , a group of gram-positive bacteria, producing more than 50% of known antibiotics. To increase antibiotic level production in these organisms, the pathway of antibiotic precursors, like tryptophan, must be studied. The trpX gene is a little Streptomyces coelicolor orf, coding for a hypothetical 63-amino acids protein, TrpX , having, to date, unknown function. This gene is present in the trpA/B/X/C1 operon, coding for important enzymes involved in the tryptphan biosynthesis pathway, a aromatic amino acid. Real-Time RT-PCR analysis showed that trpX is not costitutively expressed during the growth in minimal medium, but is growth-phase dependent. In silico approaches and previous experiments have shown that TrpX protein is a putative regulator of the trpB gene, a gene involved in the tryptophan biosynthesis and a tridimentional structure prediction showed that TrpX protein could have a DNA-binding protein structure. The most probable hypothesis of the TrpX protein function in S. coelicolor, is that it binds to intergenic regions of the trpA/B/X/C1 operon, regulating the trpB gene expression. This hypothesis has not been confirmed by DNA binding assays carried out in this work, thus, further DNA or RNA binding assays are necessary. The His6-TrpX protein was successfully overproduced in E. coli, and its purification at present is in progress, it will be used in DNA or RNA binding assays, in order to confirm the previous hypothesis. The trpX gene overexpression in S. coelicolor, indicating ways to understand trpX function, has not been obtained, but new strategies at present are in progess.