Technologies du vivant - Life Technologies

Evaluation of the feasibility of applying liquid-core capsules for in-situ product recovery of geldanamycin in a streptomyces hygroscopicus fermentation = Untersuchung der Machbarkeit, Alginatkapseln zur

Burlet, Justine ; Crelier, Simon (Dir.)

Mémoire de diplôme HES : Haute Ecole d'Ingénierie, 2007.

Objectif L’objectif de ce travail était de produire des capsules d’alginate contenant un noyau liquide d’une phase organique, et de caractériser celles-ci par rapport à leur distribution de taille et par rapport au transfert de masse. Ensuite la faisabilité d’intégrer la récolte de Geldanamycin (GM) d’une culture Streptomyces (S.) hygroscopicus avec ces capsules était établie.... Plus

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    Résumé
    Objectif L’objectif de ce travail était de produire des capsules d’alginate contenant un noyau liquide d’une phase organique, et de caractériser celles-ci par rapport à leur distribution de taille et par rapport au transfert de masse. Ensuite la faisabilité d’intégrer la récolte de Geldanamycin (GM) d’une culture Streptomyces (S.) hygroscopicus avec ces capsules était établie. Les caractéristiques physico-chimiques de la récolte intégrée de GM, comme la solubilité, la stabilité, le coefficient de partage dans un système 2 phases aqueux-organique, étaient évaluées. La production de GM dans une culture de S. hygroscopicus var. geldanus était suivie afin de déterminer si le GM avait un effet inhibiteur et de définir l’efficacité de l’ajout des capsules dans une culture. Résultats Les Capsules d’alginate contenant un core de Dibutyl sebacate (DBS) comme phase organique étaient produites avec un diamètre moyen des capsules de 0.712 ± 0.040 mm et un diamètre moyen des noyaux de 0.554 ± 0.030 mm. Une capacité d'extraction de 3,48 mgGM/gDBS pourrait être mesurée pour GM avec les capsules produites. Ce qui est plus élevé que la capacité d’extraction de DBS non-encapsulé qui était de 2.2 mgGM/gDBS. Les capsules avaient montré un taux d’adsorption initial de 843.7 mgGM/(l*h) à 28°C et de 405.61 mg GM/(l*h) à 20°, ce qui indique que le transfert de ma sse est limité à cause de la diffusion à travers de la membrane d’alginate des capsules. Les expériences ont montré que la solubilité de GM dans l’eau était très faible, par contre elle était relativement élevée dans différents solvants comme dimethylsulfoxide, acétonitrile et DBS. Il avait aussi été montré que GM était instable dans les solutions aqueuses aux conditions de culture en présence de O2 et à de faibles valeurs de pH. Par contre GM était stable dans DBS. En suivant la concentration de GM pendant la culture de S. hygroscopicus, une dégradation de GM a été observe à la fin de la culture. L’étude de l’inhibition du produit par GM dans une culture de S. hygroscopicus a montré que la présence de GM ne causait pas d’inhibition pour la production de GM. Par contre, un ajout de GM au début de la culture augmentait la production de GM. Par conséquent, il est possible d’utiliser des capsules d’alginate, contenant un noyau liquide de DBS, pour la récolte intégrée de GM dans une fermentation de S. hygroscopicus. Car GM a montré une meilleure stabilité dans DBS que dans le milieu de culture.
    Zusammenfassung
    Ziel Das Ziel dieser Arbeit war, Mikrokapseln mit einem flüssigen Kern, die zum integrierten Aufarbeitungsprozess von Geldanamycin (GM) in einer Streptomyces (S.) hygroscopicus Kultur dienen sollen, herzustellen und aufgrund ihrer Grössenverteilung und Massentransfer zu charakterisieren. Anschliessend sollte die integrierte Aufarbeitung von GM mittels Mikrokapseln untersucht und ausgetestet werden. Dazu wurden vorerst die physiko-chemischen Eigenschaften von GM, wie Löslichkeit, Stabilität, Verteilungskoeffizient in organisch-wässrigen 2-Phasen Systemen untersucht und die Produktion von GM in einer S. hygroscopicus var. geldanus Kultur verfolgt. Dabei wurde die Produktinhibition von GM untersucht und die Zugabe von Mikrokapseln in eine Kultur ausgetestet. Resultate Mikrokapseln mit Dibutyl sebacate (DBS) als flüssigen Kern konnten mit einer guten Monodispersion und Homogenität hergestellt werden. Ein durchschnittlicher Kapseldurchmesser von 0.712 ± 0.040 mm mit einem durchschnittlichen Kerndurchmesser von 0.554 ± 0.030 mm konnten dabei hergestellt werden. Die Kapseln zeigten für GM eine extraktive Kapazität von 3.48 mgGM/gDBS, was eine grössere Kapazität darstellte als bei nicht-verkapseltem DBS, wo eine Kapazität von nur 2.2 mgGM/gDBS ermittelt werden konnte. Die Kapseln zeigten Anfangsadsorptionsgeschwindigkeiten von 843.7 mgGM/(l*h) bei 28°C und 405.61 mg GM/(l*h) bei 20°C, was darauf hinwies, dass die Resistenz des Ma ssentransfers von GM in die Kapseln hauptsächlich durch die Diffusion durch die Kapselwand aus Alginat verursacht wird. Löslichkeitsuntersuchungen von GM haben gezeigt, dass GM eine sehr schwache Löslichkeit in Wasser besitzt, hingegen eine relativ gut löslich in Lösungsmitteln wie Dimethylsulfoxid, Acetonitril und DBS. Die Stabilitätstests zeigten, dass GM instabil in wässrigen Lösungen bei Kultivationsbedingungen ist in Gegenwart von O2 und bei tiefen pH-Werten. Hingegen zeigte GM in Dibutyl sebacate eine sehr gute Stbilität. Bei der Produktion von GM in S. hygroscopicus Kulturen konnte ein starker Abbau von GM am Ende der Kultivierung beobachtet werden. Es konnte gezeigt werden, dass GM im Kulturmedium aufgrund freigesetzter Proteine durch die Zellen instabil ist und zerfällt. Die Untersuchungen der Produktinhibition von GM in S. hygroscopicus Kulturen haben gezeigt, dass die Anwesenheit von GM in einer S. hygroscopicus Kultur keine Produktinhibition aufzeigt, sondern sogar eine erhöhte Produktion von GM erzeugt, wenn GM zu Beginn der Kultivierung dazugegeben wurde. Es konnte aufgezeigt werden, dass es machbar ist, Alginatkapseln mit DBS als flüssigen Kern zur integrierten Produktaufarbeitung von GM in einer S. hygroscopicus Fermentation anzuwenden, und die Ausbeute an GM zu verbessern.
    Summary
    Objective The aim of this work was to produce Liquid-Core capsules for the In-Situ Product Removal (ISPR) of Geldanamycin (GM) from a Streptomyces (S.) hygroscopicus culture. These capsules were characterized for their size distribution and mass transfer characteristics. Then the feasibility of the ISPR of GM through Liquid-Core capsules was evaluated and tested. Therefore the physical-chemical properties of GM, such as solubility, stability, partition coefficient in organic-aqueous 2-phase systems were investigated. The production of GM in S. hygroscopicus var. geldanus cultures was then monitored in order to investigate if there was a product inhibitory effect of GM and to test the application of the Liquid-Core capsules as a tool for ISPR of GM in a culture. Results Monodispersed and homogenous Liquid-Core capsules, with Dibutyl sebacate (DBS) as the capsule core, were produced with an average capsule diameter of 0.712 ± 0.040 mm and an average core diameter of 0.554 ± 0.030 mm. An extractive capacity of 3.48 mgGM/gDBS could be measured for the capsular perstraction of GM with the produced capsules. This was a much higher capacity than for non-encapsulated DBS, where only a capacity of 2.2 mgGM/gDBS could be achieved. The capsules showed an initial adsorption rate of 843.7 mgGM/(l*h) at 28°C and 405.61 mg GM/(l*h) at 20°C, which indicates that the main mass transfer resistance is due to the diffusion through the capsule wall. Solubility tests showed that the solubility of GM in water is very low, but rather high in different solvents like Dimethyl sulfoxide, Acetonitrile and Dibutyl sebacate. The stability tests showed that GM was unstable in aqueous solutions under culture conditions in the presence of O2 and at low pH values. However in Dibutyl sebacate a good stability of GM could be shown. Through monitoring of GM production during the cultivation of S. hygroscopicus a strong degradation of GM could be observed at the end of the cultivation, possibly due to proteins/ enzymes liberated by the cells. Investigations of the product inhibition of GM in a S. hygroscopicus culture showed that the addition of GM in a culture doesn’t inhibit the GM production, but actually increases GM production. It could be shown that it is feasible to apply Liquid-Core capsules for the ISPR of GM in a S. hygroscopicus fermentation, as GM is more stable in the organic solvent used for the liquid core of the capsules and also because GM degrades spontaneously under culture conditions and as a result of proteins liberated by cells during cultivation. Consequently Liquid-Core capsules as a form of ISPR would be a possibility to overcome these problems and increase the overall yield of geldanamycin