Technologies du vivant - Life Technologies

Développement de vecteurs viraux permettant une expression spécifique du transgène dans les neurones = Entwicklung von viralen Vektoren zur Neuron-spezifischen

Thevenet, Jonathan ; Schmid, Sergio (Dir.)

Mémoire de diplôme HES : Haute Ecole d'Ingénierie, 2007.

Objectif Ce projet consiste à développer une série de constructions pour la production de virus recombinants adéno-associés (AAV), permettant une expression du transgène dans les neurones, à l’aide de différents promoteurs spécifiques. Ces constructions seront appliquées pour l’expression de transgènes pathogéniques et neuroprotecteurs dans un modèle animal génétique de la... Plus

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    Résumé
    Objectif Ce projet consiste à développer une série de constructions pour la production de virus recombinants adéno-associés (AAV), permettant une expression du transgène dans les neurones, à l’aide de différents promoteurs spécifiques. Ces constructions seront appliquées pour l’expression de transgènes pathogéniques et neuroprotecteurs dans un modèle animal génétique de la maladie de Parkinson. Résultats Les différents virus de type AAV sont générés par recombinaison entre une construction receveuse contenant le génome de l’AAV2 et de trois plasmides donneurs différents contenant les promoteurs neurospécifiques synapsine, prion ou énolase, à l’aide du système Gateway® développé par Invitrogen. Le gène rapporteur codant pour la protéine fluorescente FPmax est cloné pour tester l’expression obtenue. Le promoteur du cytomégalovirus (CMV) est utilisé comme promoteur ubiquitaire de référence. Dans un deuxième temps, la fonctionnalité des plasmides générés, ainsi que des vecteurs viraux AAV de sérotype 6 produits à partir de ces plasmides, est testée dans différents types cellulaires. Tout d’abord, chaque plasmide est transfecté dans des cellules humaines rénales HEK 293T par précipitation au phosphate de calcium. Contrairement au promoteur CMV, les trois promoteurs neurospécifiques n’induisent pas d’expression dans ce type cellulaire et l’expression du transgène n’interfèrera donc pas avec la production virale effectuée dans ce même type cellulaire. Les différents virus sont ensuite produits afin de tester leur expression in vitro et in vivo. L’expression et la spécificité des constructions sont testées, in vitro, par infection de co-cultures primaires de cellules neuronales et gliales. Bien que l’expression virale ne présente pas une distribution strictement neuronale, les taux d’expression obtenus dans ces deux types cellulaires reflètent clairement leur spécificité. Le promoteur synapsine est fortement neurospécifique, prion est strictement neuronal mais présente une très faible expression tandis que le promoteur énolase est peu spécifique. Le promoteur CMV possède une forte expression au niveau des cellules gliales. In vivo, les virus sont testés par injection stéréotaxique dans la substance noire chez le rat. Au contraire du spectre d’infection observé in vitro, l’AAV possède un tropisme presque exclusivement neuronal dans cette structure, qui ne permet donc pas une évaluation de la spécificité cellulaire de l’expression. Les différents promoteurs montrent une nette expression dans les neurones dopaminergiques, mais plus faible qu’avec le promoteur CMV. Sur cette base, le promoteur synapsine est sélectionné pour le clonage de l’α-synucléine, un gène impliqué dans la pathogenèse de la maladie de Parkinson. Le virus est produit mais n’a pu être testé dans le cadre de cette étude. Bien que les promoteurs neurospécifiques procurent un premier degré de spécificité cellulaire dans le niveau d’expression, ils ne permettent pas d’obtenir une expression strictement confinée à un certain type cellulaire. Chaque type cellulaire exprime un ensemble de microARN endogènes qui lui est propre. La présence de ces ARN peut être exploitée pour réprimer la traduction de transcrits portant la séquence cible du microARN, afin d’améliorer la spécificité cellulaire de l’expression du transgène. Dans le but de contrôler l’applicabilité de cette approche in vivo, la répression de l’expression via le clonage de la séquence cible du microARN mir-133b, qui est exprimé spécifiquement dans les neurones dopaminergiques de la substance noire, est testée au niveau des neurones dopaminergiques. Malheureusement, l’insertion de quatre copies de la séquence cible du mir-133b dans la partie 3’ non traduite du transgène FPmax sous le contrôle du promoteur CMV, ne permet pas une répression majeure de l’expression de la protéine FPmax au niveau des cellules neuronales de la substance noire.
    Zusammenfassung
    Zielsetzung Das vorliegende Projekt bestand in der Aufgabe, eine Palette von Konstrukten zur Produktion von Adeno-assoziierten rekombinanten Viren zu entwickeln, die es, mittels verschiedener spezifischer Promotoren, erlauben würeden, bestimmte Transgene spezifisch in neuronalen Zellen zu exprimieren. Diese Konstrukte werden im Weiteren verwendet werden, um verschiedene pathogene und protektive Transgene in einem Parkinson-Tiermodell zu testen. Resultate Die verschiedenen Konstrukte wurden hergestellt durch die Rekombination eines Empfänger- Plasmids, das das Genom für den AAV-2 enthält, und drei verschiedener Geber-Plasmide, die entweder die Sequenz für Neuron-spezifisches Synapsin, diejenige für Neuron-spezifisches Prionprotein, oder aber diejenige für Neuron-spezifische Enolase enthalten. Die Rekombinationsreaktion wurde mittels dem sogenannten Gateway® -System (Invitrogen) erzielt. Um die jeweilige Expressionsstärke der Vektoren direkt ermitteln zu können, wurde als Transgen das Gen für das FPmax-Markerprotein hinzugefügt. Der Cytomegalovirus-Promoter schliesslich wurde wegen seinem weitverbreiteten Expressionsmuster als Referenzpromotor verwendet. In einer zweiten Phase des Projekts wurden die so hergestellten Plasmid-Konstrukte, sowie die daraus resultierenden Virusvektoren (AAV6), ausführlich auf ihre Funktionalität hin in verschiedenen Zelllinien getestet. Zuerst wurde jedes einzelne Konstrukt zur Calcium/Phosphat-Transfektion von humanen HEK 293T-Zellen verwendet. Im Gegensatz zum CMV-Promotor führten die drei anderen Plasmide zu keinerlei Transgenexpression – was uns auch zeigt, dass es bei der Virusproduktion in der 293T-Zelllinie voraussichtlich nicht zu Komplikationen kommen sollte, die auf eine Transgenexpression zurückzuführen wären. Die verschiedenen Virusvektoren wurden anschliessend auf ihre Expressionsstärke und Zelltyp- Spezifizität hin in vitro und in vivo getestet. In vitro geschah dies durch die Infektion von Kulturen, die sowohl Neuronen wie Glia enthiellten. Auch wenn das Expressionsmuster nicht ausschliesslich neuronal war, so spiegelte doch die quantitative Expression in den zwei Zelltypen eine Neuron-spezifische Infektivität wider. Der für Synapsin codierende Promotor zeigte sich als klar neuronal und wies eine hohe Infektionsrate auf ; der Prion-Promotor erwies sich als am ausschliesslichsten Neuron-spezifisch, war aber nicht sehr effizient ; der Enolase-Promotor stellte sich als der wenigst Zelltyp-spezifische heraus. Der als Referenz verwendete CMV-Promotor zuletzt exprimierte das getestete Transgen vorallem in den Glia. In vivo wurden die Virusvektoren sterotaxisch in die Substantia Nigra von Ratten injiziert. Im Gegensatz zu den Tests, die wir in vitro ausführen konnten, besitzt der AAV6 in dieser Hirnregion ohnehin schon eine fast auschliessliche Affinität für Neuronen – weshalb wir hier die zellspezifische Transgenexpression nicht testen konnten. Alle verwendeten Vektoren zeigten eine klares Expressionsmuster in den dopaminergen Nervenzellen, während der CMV-Promotor die schwächste Infektivität und niedigste Expressionsrate aufwies. Im Licht dieser Resultate wurde der Synapsin-Promotor ausgewählt, um damit ein Konstrukt herzustellen, das anstelle des Markerproteins das mit der Pathogenese von Parkinson assoziierte - Synuclein-Protein exprimieren würde. Der entsprechende Viursvektor wurde bereits hergestellt – ist aber aus Zeitgründen nicht mehr im Rahmen des beschriebenen Projekts getestet worden. Abschleissend ist zu sagen, dass, obwohl diese Promotoren einen ersten Schritt in Richtung einer Neuron-lastigen Expression darstellen, ein ausschliesslich neuronaler Tropismus damit noch nicht erreicht ist. Jeder Zelltyp exprimiert jedoch eine Auswahl an sogenannten microRNAs, die man sich zu Nutze machen könnte, um die Transkription derjeniger Transkripte zu unterdrücken, die die entsprechende Zielsequenz tragen. Auf diese Weise könnte man womöglich am Ende das Expressionsmuster des jeweiligen Transgens auf einen Zelltyp beschränken. Mit dem Ziel, die Umsetzbarkeit dieser Methode in vivo zu testen, haben wir zu ermitteln versucht, ob die Transgenexpression in dopaminergen Neuronen mittels der Vewendung der Sequenz für die microRNA mir-133b, die spezifisch in dopaminergen Nervenzellen der Substantia Nigra vorhanden ist, unterdrückt werden kann. Unglücklicherweise zeigte diese Zielsequenz, deren vier Kopien in das nicht-transkribierte 3’-Ende des FPmax unter der Kontrolle des CMV- Promotors kloniert wurden, keine klare Unterdrückung des FPmax in den dopaminergen Neuronen.