Technologies du vivant - Life Technologies

Identification of the genetic elements involved in pediocin PD-1 synthesis = Identification des éléments génétiques impliqués dans la

Dumas, Stéphane ; Schmid, Sergio (Dir.)

Mémoire de diplôme HES : Haute Ecole d'Ingénierie, 2007.

Objectif: Confirmer la présence du gène pedA, partie de l’opéron de pédiocine PD-1 connue, dans un des plasmides de Pediococcus damnosus. Construire une banque plasmidique en utilisant ce plasmide isolé, digéré avec des endonucléases avant d’être cloné dans le vecteur pZErO-2. Identifier les plasmides recombinants contenant le gène pedA par criblage PCR ou/et par hybridation avec... Plus

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    Résumé
    Objectif: Confirmer la présence du gène pedA, partie de l’opéron de pédiocine PD-1 connue, dans un des plasmides de Pediococcus damnosus. Construire une banque plasmidique en utilisant ce plasmide isolé, digéré avec des endonucléases avant d’être cloné dans le vecteur pZErO-2. Identifier les plasmides recombinants contenant le gène pedA par criblage PCR ou/et par hybridation avec une sonde pedA. Séquencer l’insert et localiser la région pedA afin d’identifier la partie de l’insert restant qui permet d’étendre la partie connue de l’opéron PD-1. Trouver l’ORF de cette séquence. Résultats: Le gène pedA a été confirmé dans un plasmide de P.damnosus mais sa purification a donné une très basse concentration d’ADN. Une banque plasmidique, composée de 160 clones a été construite à partir de ce plasmide digéré avec EcoRI et HindIII ; aucun plasmide recombinant positif n’a été trouvé. Une autre banque plasmidique, composée de 82 clones, a donc été construite, et stockée, avec l’ADN plasmidique de P.damnosus digéré avec EcoRI; 3 plasmides recombinants positifs ont été trouvés (p60, p70 et p76). La carte génétique de ces trois plasmides indique le même insert d’environ 3300 bp. L’insert de p60 a été séquencé et ne présente aucune région pedA mais pourrait être un plasmide de P.damnosus similaire à pF8801. Une 3ème banque plasmidique a été créée, et stockée, avec l’ADN plasmidique de P.damnosus digéré avec HindIII, pas encore analysée.
    Summary
    Aim: Confirm the presence of pedA gene, known part of pediocin PD-1 operon, in one of Pediococcus damnosus plasmids. Construct a plasmid library using this isolated plasmid, digested with endonucleases and subcloned in pZErO-2 vector. Identify recombinant plasmids containing pedA gene by PCR screening or/and by hybridization with pedA probe. Sequence the insert and localize pedA region in order to identify the remaining part of the insert, used to expand pediocin PD-1 operon known sequence. Identify ORF on this sequence. Results: pedA gene has been confirmed in one of P.damnosus plasmid but its purification gave weak DNA concentration. A plasmid library composed of 160 clones has been created using this purified plasmid, digested with EcoRI and HindIII; no pedA positive recombinant plasmids have been found. Another plasmid library composed of 82 clones has been built and stored using total P.damnosus plasmid DNA, digested with EcoRI; three pedA positive recombinant plasmids have been found (p60, p70 and p76). Genetic maps of these plasmids show they possess the same insert with an estimated size of 3300 bp. p60 DNA sequencing shows no pedA region but could be one of P.damnosus plasmids partially homologous to pF8801. A 3rd plasmid library, composed of 63 clones, has been built and stored using total P.damnosus plasmid DNA, digested with HindIII, not yet analyzed.